Захист відбудеться “ 3 ” травня 2018 року о 15 год

БАУМКЕТНЕРАндрій Богданович

УДК 538.9; 539.2; 577; 544

НОВІ АСПЕКТИ ЗГОРТАННЯ ТА АГРЕГАЦІЇ БІЛКІВ:

ТЕОРІЯ ТА КОМП’ЮТЕРНЕ МОДЕЛЮВАННЯ

01.04.24 – фізика колоїдних систем

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора фізико-математичних наук

ЛЬВІВ – 2018

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті фізики конденсованих систем Національної академії наук України

Науковий консультант – доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Брик Тарас Михайлович, Інститут фізики конденсованих систем НАН України (м. Львів), завідувач відділу комп’ютерного моделювання багаточастинкових систем, заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти – член-кореспондент НАН України, доктор біологічних на- ук, професор Корнелюк Олександр Іванович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ), завідувач відділу білкової інженерії та біоінформатики – доктор фізико-математичних наук, старший науковий

співробітник Шестопалова Ганна Вікторівна, Інститут радіофізики та електроніки ім.О.Я.Усикова НАН України (м. Харків), завідувач відділу біологічної фізики

– доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Єсилевський Семен Олександрович, Ін- ститут фізики НАН України (м. Київ), провідний науковий співробітник відділу фізики біологічних систем

Захист відбудеться “ 3 ” травня 2018 року о 15 год. 30 хв. на засіданні спеціалі- зованої вченої ради Д 35.156.01 при Інституті фізики конденсованих систем Націо- нальної академії наук України за адресою:

79011, м. Львів, вул. Свєнціцького, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Інституту фізики конден- сованих систем НАН України за адресою:

79026, м. Львів, вул. Козельницька, 4.

Автореферат розісланий “ 2 ” квітня 2018 року.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 35.156.01, доктор фіз.-мат. наук

А.М. Швайка

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з найважливіших напрямків фізики колоїдних сис- тем є дослідження біологічних молекул у водних розчинах та кінетики утворення білкових агрегатів. Зацікавленість біологічними макромолекулами сягає далеко поза межі біології. Для низки суміжних дисциплін, що включають фізику, хімію та мате- матику, фундаментальні властивості білків, як колективні так і індивідуальні, пред- ставляють значний науковий інтерес.

Зокрема, однією зі слабо вивчених проблем є фазове розшарування типу рідина- рідина у водних розчинах білка.¹ Фаза з високим вмістом білка, або по-іншому рідка фаза, яка виникає в розчині внаслідок охолодження, зустрічається в багатьох кон- текстах. Наприклад, вона виступає в ролі кінетичного прекурсора для кристалізації² в розчинах альбуміну. В кристалику ока³ рідка фаза білка кристаліну асоціюється з явищем холодної катаракти. Також вважається, що утворення крапель концентро- ваної білкової рідини лежить в основі механізму, за допомогою якого у цитоплазмі живих клітин з’являються такі немембранні утворення, як ядерця або центросоми.⁴ Для фізики колоїдних систем явище фазового розшарування - це одна з найбільш актуальних проблем. Досі залишається незрозумілим, який опис білка необхідно ви- користовувати для того, щоб вірно описати особливості фазової поведінки при зміні зовнішніх умов, таких як рівень рН.⁵ Більше того, модель білка, яка правильно опи- сує, як фазову поведінку розчину, так і його структуру - не існує.

Також значний інтерес викликають білкові кластери.⁶ Крім білків кластери спо- стерігаються в багатьох інших колоїдних системах, наприклад синтетичних клеях⁷ та металічних наночастинках.⁸ За відповідних умов кластери приходять у стан тер- модинамічної рівноваги з іншими компонентами системи. Вони також можуть з’являтися тимчасово, внаслідок незавершеного фазового переходу.⁹ Як частковий випадок явища самоорганізації, процес утворення кластерів є однією з центральних проблем фізики колоїдних систем. На жаль наші теперішні знання про цей процес є достатньо обмеженими.¹⁰ На сьогодні відомо про два типи між-частинкових потен- ціалів, що приводять до утворення рівноважних кластерів: а) потенціали з конкуру- ючими притяганням та відштовхуванням, та б) суто відштовхувальні потенціали.

Незрозуміло чи цей список є вичерпним. Також бракує інформації про термодина- мічні фактори, що контролюють збірку кластерів. Без цього буде важко передбачити

1 C. Ishimoto and T. Tanaka, Phys. Rev. Lett. 39, 474 (1977), ibid.

2 F. Zhang, R. Roth, M. Wolf, F. Roosen-Runge et al, Soft Matter 8, 1313 (2012).

3 G. Benedek, Human Cataract Formation, 237 (1984).

4 A. A. Hyman, C. A. Weber, and F. Jülicher, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 39 (2014).

5 M. C. Abramo, C. Caccamo, D. Costa, G. Pellicane et al, J. Chem. Phys. 136, 035103 (2012).

6 A. Stradner, H. Sedgwick, F. Cardinaux, W. C. K. Poon, S. U. Egelhaaf, and P. Schurtenberger, Nature 432, 492 (2004).

7 A. K. Atmuri and S. R. Bhatia, Langmuir 29, 3179 (2013).

8 J. M. Tam, A. K. Murthy, D. R. Ingram, R. Nguyen, K. V. Sokolov, and K. P. Johnston, ibid.26, 8988 (2010).

9 E. Janai, A. B. Schofield, and E. Sloutskin, Soft Matter 8, 2924 (2012).

10 A. D. Dinsmore, P. L. Dubin, and G. M. Grason, J. Phys. Chem. B 115, 7173 (2011).

вплив кластерів на різноманітні нові властивості розчинів, як наприклад ріст в'язко- сті, що спостерігається в розчинах моноклонних антитіл.¹¹ Ще важче собі уявити раціональне використання кластерів в практичних застосуваннях, зокрема для адре- сної доставки ліків.¹²

Останнім часом дуже великі зусилля спрямовуються на з’ясування принципів, що лежать в основі згортання білків.¹³ Незважаючи на це, все ще залишається велике коло задач, для яких рівень розуміння є далеким від задовільного. Зокрема, це сто- сується процесу згортання за посередництва молекулярних шаперонів. Добре відо- мо, що лише від 65 до 80% новосинтезованих в живій клітині білків здатні згортати- ся спонтанно. Всі інші потребують зовнішньої допомоги, зокрема від шаперонів.¹⁴ Шаперони,такі як комплекс GroEL/ES¹⁵ в бактерії кишкової палички, надають по- рожнину (комірку) в яку поміщаються ті білки які не можуть згорнутися самостійно. Структура комірки відома з кристалографічних досліджень. Однак ме- ханізм її роботи залишається нез’ясованим. Вхід в комірку періодично відкриваєть- ся та закривається, що дає білкам декілька спроб згорнутися успішно. Підтримувана гідролізом АТФ циклічність лягла в основу моделі ітеративного відпалу(ІАМ)¹⁶фу- нкціонування шаперона. Альтернативна теорія, так звана модель Анфінсена, ствер- джує, що мета з якою білок поміщається в комірку – це ізоляція від інших молекул в клітинному середовищі, що дозволяє уникнути непродуктивних взаємодій, в першу чергу агрегації. Котра з цих моделей краще узгоджується з експериментом, і наскі- льки вона є універсальною, на даний момент – незрозуміло. Ключовим аспектом, в якому дві моделі відрізняються, є роль комірки: активна комірка, яка механічно впливає на білок у випадку IAM, та пасивна комірка, яка слабо взаємодіє з білком в моделі Анфінсена.

Багато білих плям також існує в нашому розумінні роботи моторних білків. Зок- рема, для м’язового білка міозину структурні стани M* та M**, між якими відбува- ється перехід, що відновлює здатність білка генерувати силу - так-званий стрибок відновлення, - відомі з кристалографічних досліджень. У стані зі зв’язаним АТФ,¹⁷ стрибок відновлення є зворотнім та контролюється термодинамічними факторами, такими як температура чи тиск.¹⁸ На жаль мікроскопічні деталі переходу в криста- лографічних дослідженнях недоступні. Багато чого про динаміку переходу можна довідатись за допомогою спектроскопічних методів, що вимірюють відстань між вибраними залишками, такими як флуоресцентний резонансний перенос енергії¹⁹ чи

11 E. J. Yearley et al., Biophys. J. 106, 1763 (2014).

12 S. Xu, C. Sun, J. Guo, K. Xu, and C. Wang, J. Mater. Chem. 22, 19067 (2012).

13 S. W. Englander and L. Mayne, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 15873 (2014).

14 F. U. Hartl and M. Hayer-Hartl, Science 295, 1852 (2002).

15 H. R. Saibil, A. L. Horwich, and W. A. Fenton, Allostery and protein substrate conformational change during GroEL/GroES-mediated protein folding (Academic Press, 2002), Vol. 59.

16 M. J. Todd, P. V. Viitanen, and G. H. Lorimer, Science 265, 659 (1994).

17 A. Malnasi-Csizmadia, D. S. Pearson, M. Kovacs et al, Biochemistry 40, 12727 (2001).

18 Ibid.

19 R. V. Agafonov, I. V. Negrashov, Y. V. Tkachev et al , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21625 (2009).

спінове ехо.²⁰ Проте ці методи не мають атомної роздільної здатності, що робить інтерпретацію їх результатів утрудненою. Без з’ясування механізму переходу відно- влення важко зрозуміти які взаємодії чи залишки його контролюють. Серед інших негативних наслідків, це унеможливлює з’ясування механізму виникнення кардіо- міопатій - хвороб, спричинених мутаціями в первинній структурі міозину, - без чого марно сподіватися на розробку необхідних ліків.

Мабуть найбільш актуальною проблемою на даний час є агрегація білків²¹ – яви- ще утворення макромолекулярних комплексів внаслідок само-асоціації. Спостері- гаються як невпорядковані, у формі неструктурованого преципітату, так і впорядко- вані агрегати. До останніх належить амилоїд. Історично амилоїд вперше викликав науковий інтерес завдяки своєму зв'язку з хворобами головного мозку,²² коли було встановлено, що мозок людей з хворобою Альцгеймера (AD), Паркінсона та низки інших нейродегенеративних розладів містять нерозчинні плашки багаті на β−структуру, амилоїдні фібрили, що складаються з білка певного типу, різного для різних хвороб. Для хвороби Альцгеймера, наприклад, це амилоїд β−пептид, Aβ. Вже зараз число хворих з AD вимірюється багатьма мільйонами а з часом - лише різко збільшиться, оскільки наступ хвороби пов’язаний з віком, а середній вік населення росте. Подібна картина спостерігається для інших споріднених розладів. Тому про- блема винайдення ліків від цієї недуги стоїть дуже гостро. Першим і необхідним кроком на цьому шляху є зрозуміти фізику утворення фібрил. До найбільш нагаль- них задач належать: 1) встановлення мікроскопічної структури фібрили та факторів, що її контролюють, 2) з’ясування механізму утворення, 3) дослідження впливу се- редовища, наприклад змінного рН, та варіацій первинної структури, що виникають зокрема у вроджених формах хвороби.

Масштаб окреслених проблем значний і вимагає комплексних підходів для досяг- нення помітного прогресу. Важливе місце в таких підходах займає комп’ютерне мо- делювання. Дуже часто моделювання виступає як самостійний дослідницький ін- струмент, наприклад для встановлення структури фібрил.²³ В інших випадках моде- лювання доповнює та підсилює експериментальні підходи, яким бракує атомної ро- здільної здатності.²⁴ В усіх випадках успіх моделювання залежить від якості розра- хункової моделі. В застосуванні до фібрил, ключовою вимогою до моделі є її атомне представлення, оскільки хімічні деталі сильно впливають на шляхи агрегації.²⁵ Вод- ночас, модель має бути достатньо простою, щоб дозволити оперативні чисельні роз- рахунки. На даний час існує лише невелике число таких моделей, що здатні відтво- рити спонтанне утворення β-листів.²⁶ Проте наразі невідомо до яких систем ці мо-

20 R. V. Agafonov, Y. E. Nesmelov, M. A. Titus, and D. D. Thomas, ibid.105, 13397 (2008).

21 L. M. Luheshi, D. C. Crowther, and C. M. Dobson, Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 25 (2008).

22 O. S. Makin, P. Sikorski, and L. C. Serpell, ibid.10, 417 (2006).

23 B. Y. Ma and R. Nussinov, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 14126 (2002).

24 D. B. Teplow et al., Acc. Chem. Res. 39, 635 (2006).

25 G. Bitan, M. D. Kirkitadze, A. Lomakin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 330 (2003).

26 A. Irback and S. Mitternacht, Proteins-Structure Function and Bioinformatics 71, 207 (2008).

делі застосовні. Тому тут чітко прослідковується потреба в подальшому розвитку теоретичних моделей. При цьому найбільша необхідність виникає в моделях, що роблять акцент на великих білкових системах та їх агрегатах.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна ро- бота виконана в Інституті фізики конденсованих систем НАН України. Представле- ні результати отримані в рамках наступних бюджетних тем НАН України: “Немар- ківські кінетичні та гідродинамічні процеси у конденсованих системах” (2002-2004 рр., № держреєстрації 0102U000216), “Розвиток та застосування статистико- механічних підходів у теорії складних рідин” (2005-2007 рр., 0105U002082), “Стати- стико-механічні та комп’ютерні дослідження властивостей складних рідин” (2008 р., 0108U001153), “Розвиток теорії складних плинів і міжфазних областей: фазова по- ведінка, структурні, термодинамічні та динамічні властивості” (2009-2013 рр., 0109U001058 ), “Багатомасштабність і структурна складність конденсованої речо- вини: теорія і застосування” (2012-2016 рр., 0112U003119), “Вплив молекулярної структури і процесів локального впорядкування на фізичні властивості багаточасти- нкових систем” (2014-2018 рр., 0114U001048), “Нові концепції статистичного опису і їх застосування у теорії багаточастинкових систем” (2017-2018 рр., 0117U002093).

Автор також брав участь у виконанні програмно-цільової та конкурсної тематики НАН України за темами: “Західний грід-центр УНГ: розвиток технічного потен- ціалу, комп’ютерне моделювання у грід-середовищі та підготовка кадрів”. Етап 1(2014 р., 0114U002631), Етап 2 (2015 р., 0115U001291), Етап 3 (2016 р., 0116U005785), Етап 4 (2017 р., 0117U000954).

Мета та задачі дослідження. Метою цієї роботи є розвиток теоретичних методів та моделей для досліджень білків. В рамках цієї мети вирішуються наступні конкре- тнізадачі:

• Дослідження колективних властивостей білків. Встановлення необхідного рі- вня опису та запровадження необхідних моделей.

• Опис процесів утворення кластерів у білкових розчинах.

• З’ясування ролі обмежуючої комірки в процесі згортання білків за допомогою шаперонів.

• Розробка моделі для агрегації білків, яка має атомну роздільну здатність, про- те є достатньо простою і реалістичною для моделювання малих пептидів.

• Дослідження ролі зовнішнього електричного поля в процесах згортання та аг- регації білків.

• З’ясування деталей структурного переходу стрибка відновлення в моторному білку міозину.

• Дослідження структури на вплив зовнішніх факторів на амилоїдні фібрили.

Вибір цих задач продиктований наступними критеріями. 1) Наявна певна інфор- мація про досліджуваний процес, що спирається на експериментальні джерела. Ба- жано, щоб була сформована чітка гіпотеза, яка потребує перевірки. 2) Експеримен-

тальні підходи зустрічаються з непереборними труднощами в дослідженнях процесу чи явища. Це можуть бути обмеження, пов’язані з об’єктом досліджень, наприклад, відсутність основного стану пептиду, що робить структурні дослідження методом ЯМР неоднозначними; або недостатня роздільна здатність експериментального під- ходу, наприклад, вимірювання лише однієї відстані між залишками в методі спіно- вого ехо, що не дозволяє однозначно встановити структурні зміни на атомному рів- ні.

Об’єктом досліджень є білки, олігомери та амилоїдні фібрили.

Предметом досліджень є структура білків, механізм згортання та структурних переходів білків, структура амилоїдних фібрил, залежність структури фібрил від умов середовища, вплив мутацій на згортання та агрегацію, вплив електричного по- ля на білки.

Методи досліджень. В першу чергу це аналітичні підходи статистичної фізики, такі як кумулянтні розклади, теорія фазових переходів, моделі статичної та динамі- чної поведінки, та кінетичні явища. По-друге, це методи комп’ютерного моделю- вання, включаючи стандартний метод молекулярної динаміки, підходи з вузькою спеціалізацією, щорозвинуті для конкретних задач, якнаприклад метод МонтеКар- ло в ансамблі Гіббса, чи метод обміну репліками.

Наукова новизна отриманих результатів.

В роботі запропоновано нові підходи та моделі для дослідження білків. Зокрема:

Вперше отримано ефективний потенціал міжбілкової взаємодії безпосередньо з експериментального структурного фактора без використання наближень.

Запропоновано нову несферичну модель білка, яка адекватно описує структуру білкового розчину та його фазову діаграму.

Вперше показано, що ефективний потенціал із локальним мінімумом утворює рі- вноважні кластери. Пояснено статистику цих кластерів і причини виникнення.

Вперше показано, що вплив обмежуючої комірки на кінетику згортання білка за- лежить від рівня фрустрації його поверхні вільної енергії.

Запропоновано новий механізм пришвидшення реакції згортання в комірках із притягальними стінками, що базується на утворенні проміжного стану.

Впроваджено нову модель для моделювання агрегації білків (єдину на даний час), яка коректно описує різні аспекти агрегації поліаланінових ланцюгів.

Вперше запропоновано використання електричного поля з метою контролю ами- лоїдних фібрил. Отримано нові аналітичні наближення для розрахунку впливу поля на перехід клубок-спіраль.

На основі молекулярно-динамічного моделювання вперше показано, що події за- микання ключа II та повороту домена конвертора не є механічно пов’язаними.

Вперше отримано розрахункову модель міозину, яка має функціонально- справний структурний перехід.

Запропоновано новий механізм впливу мутації E22Q на агрегацію Aβ пептиду, який добре узгоджується з експериментом.

Вперше пояснено мікроскопічні причини зміни регістру β-листів зі зміною pH у фібрилах фрагменту 11-25 пептиду Aβ.

Практичне значення отриманих результатів. Робота поглиблює розуміння функціонування біологічних систем на атомарному рівні і буде корисною для бага- тьох технологій в сучасному світі, які використовують принципи та механізми, за- позичені з біології і може бути використаною для вдосконалення сучасних біотех- нологій. Насамперед, це стосується застосування в нанотехнологіях амилоїдних фі- брил, які завдяки своїм відмінним механічним властивостям вже починають вико- ристовуватися в якості будівельного матеріалу для нанопристроїв,²⁷ нарівні з вугле- цевими нанотрубками. Значна перевага фібрил полягає в їх біосумісності.

Низка отриманих в дисертаційній роботі результатів може мати застосування в медицині. В першу чергу це стосується робіт із дослідження білка міозину, для яко- го з’ясовано деталі структурного переходу. Запропонована модель для цього білка містить залишки, які є критично важливими для його функціонування. Це, зокрема, стосується мутацій E490D, E493A, R695L, F506C, L508R та M486K, які спричиня- ють вроджену кардіоміопатію.²⁸ З’ясування механізму дії цих мутацій дозволить розробити нові лікарські засоби для цієї хвороби.

Досліджені в роботі принципи утворення білкових кластерів теж можуть вияви- тися корисними в медицині. В даний час стрімко розвиваються лікувальні засоби на основі пептидів та білків – біологіки. Одне з застосувань кластерів у таких сполуках – це адресна доставка ліків²⁹, яка використовує ключову перевагу кластерів у тому, що вони створюють високу концентрацію активної речовини локально, лише в пот- рібному місці, замість високої загальної концентрації ліків, яка спостерігається в традиційнихпідходах іможебутишкідливою.

Також в контексті застосувань слід згадати хворобу Альцгеймера та інші подібні неврологічні розлади. Хоча точні причини цих хвороб на сьогодні невідомі, але роль білкових агрегатів у їх виникненні, таких як олігомери чи фібрили, встановлена без- заперечно. Отримані в роботі результати, які проливають нове світло на властивості відповідних білків, безумовно можуть бути використані при встановленні повної патологічної картини.

Особистий внесок здобувача. В публікаціях [1-3,5-7,12,14,19,20,23] здобувач є автором ідеї досліджень та виконавцем усіх наукових завдань, включно з виконан- ням комп’ютерного моделювання. Інші автори брали участь в аналізі результатів та

27 M. Reches and E. Gazit, Nano Lett. 4, 581 (2004), K. Rajagopal and J. P. Schneider, Curr. Opin. Str. Biol. 14, 480 (2004).

28 P. Richardson et al., Circulation 93, 841 (1996), B. J. Maron, JAMA: The Journal of the American Medical Association 287, 1308 (2002).

29 K. P. Johnston, J. A. Maynard, T. M. Truskett, A. U. Borwankar, M. A. Miller, B. K. Wilson, A. K. Dinin, T. A. Khan, and K. J. Kaczorowski, ACS Nano 6, 1357 (2012).

написанні статей. У теоретичних роботах [4,13,21] здобувач брав участь в аналізі результатів та написанні статей. Статті [8,10,11] одноосібні. В статтях [9,15-18], в яких теорія поєднується з експериментом, здобувач виконував моделювання, прово- див аналіз результатів та долучився до написання статей. В роботі [22], де теж при- сутні як теорія, так і експеримент, здобувач проводив аналіз результатів моделю- вання та брав участь у написанні статті.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, представлених у ди- сертації, неодноразово доповідались на різноманітних вітчизняних та міжнародних конференціях. Серед них: Різдвяні дискусії (Львів, Україна, 11-12 січня 2017) [24], Ulam Computer Simulations Workshop “Challenges & Opportunities in Molecular Simulations” (Львів, Україна, 21-24 червня 2017) [25; 26], Summer Short Course

“Monte Carlo Methods and Applications” (Beijin, China, 26-28 June 2016) [27], X Робо- ча нарада з актуальних проблем фізики м’якої речовини (Львів, Україна, 6 листопа- да 2015) [28], XV Всеукраїнська школа-семінар і Конкурс молодих вчених зі статис- тичної фізики та теорії конденсованої речовини (Львів, Україна, 4-5 червня 2015) [29], Фестиваль науки в Інституті фізики конденсованих систем НАН України (Львів, Україна, 19-21 травня 2015) [30], IX Робоча нарада з актуальних проблем фі- зики м’якої речовини , (Львів, Україна, 7 листопада 2014) [19], VIII Робоча нарада з актуальних проблем фізики м’якої речовини (Львів, Україна, 1 листопада 2013) [31], Workshop on Protein and Peptide Interactions in Cellular Environments (Telluride, CO, USA, 19-23 July 2010), 238th ACS meeting (Washington, DC, USA, 16-20 August 2009) [32], International conference on statistical physics “StatPhys-2009” (Lviv, Ukraine, 23- 25 June 2009) [33], USA-Mexico Workshop in Biological Chemistry: Multidisciplinary Approaches to Protein folding (Mexico City, Mexico, 25-27 March 2009), Computational Biophysics with Chemical Accuracy, Zing-series conference (Jolly Beach Resort, Antigua, 14-17 January 2008), Protein folding dynamics, GRC-series conference (Ventu- ra, CA, USA, 6-11 Jan 2008) [34]. Результати також представлялись на семінарах в Інституті фізики конденсованих систем НАН України та наступних запрошених се- мінарах: Jiao Tong University, Shanghai, China, 1 July 2016, Fudan University, Shanghai, China, 2 July 2016, Західний науковий центр, Львів, Україна, 10 вересня 2015, Beijing Computational Science Research Center, Beijing, China, 6 July 2015, Укра- їнський католицький університет, семінар “Обрії науки”, 10 червня 2015.

Публікації. Матеріали дисертації представлені в 23 статтях у фахових реферова- них журналах [1-23] та 11 матеріалах конференцій [24-34].

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, п’яти розділів, в кожному з яких розглядається і вирішується конкретна проблема або низка пов’язаних задач, висновків, списку цитованих дже- рел та додатку. Роботу викладено на 288 сторінках (разом із переліком джерел 336 сторінок). Бібліографічний список містить 443 посилань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Перший розділ є оглядом літератури за п’ятьма проблемами, що безпосередньо вирішуються в роботі. У підрозділі 1.1 дано короткий вступ до проблеми моделю- вання колективної поведінки білка лізоциму. Описано відомі підходи та виклики, з якими вони зустрічаються. Дано коротку характеристику методам теорії інтеграль- них рівнянь до опису розчинівлізоциму. Підрозділ 1.2 присвячений згортаннюбіл- ків за допомогою механізму шаперонів. Приведено короткий опис існуючих теорій щодо ролі шаперонів у реакції згортання. Вказано на проблеми, які виникають як в експериментальних, так і теоретичних підходах для з’ясування цієї ролі. В підрозді- лі 1.3 описано стан досліджень, що концентруються на побудові спрощених моделей білка. Акцент робиться на моделях в атомному представленні для дослідження про- цесу агрегації. Коротко описано основні труднощі, з якими такі моделі зустрічають- ся. В підрозділі 1.4 описано підходи ватомному представленні, розвинуті длядослі- дження моторного білка міозину. Коротко висвітлено проблеми, які існують у тако- му моделюванні і спрогнозовано шляхи їх вирішення. Насамкінець, підрозділ 1.5 стосується теоретичних підходів до дослідження реакції агрегації. Спершу описано існуючі підходи/роботи до дослідження згортання пептиду, пов’язаного з хворобою Альцгеймера, Aβ. Зокрема, акцент зроблено на синергії експерименту та теорії у та- ких дослідженнях. Дальше розглянуто проблеми утворення фібрил. Подано корот- кий огляд робіт, що були зроблені в цьому напрямі. Детально обговорено задачі впливу мутацій та фрагментів Aβ.

Другий розділ присвячений дослідженню колективних властивостей білків. В першу чергу акцент робиться на процесах фазового розшарування у водяних білко- вих розчинах, зокрема в розчинах білка лізоцим. Незважаючи на те, що перші пові- домлення про розшарування рідина-рідина в таких розчинах з’явились майже 40 ро- ків тому,³⁰ інтерес до цієї системи досі не згасає.

Для теоретичного опису лізоциму найчастіше використовуються модельні поте- нціали, які адекватно відтворюють фазові діаграми,³¹ за умови, що параметризація проводиться відносно 2-го віріального коефіцієнту. Проте структурні функції білка цим потенціалом описуються не дуже коректно.³² Щоб усунути цей недолік, потен- ціал взаємодії виводиться безпосередньо з експериментальних структурних функцій задопомогоютеорії рідкого стану.³³Такі дослідженнябазуються на теоріях інтегра- льних рівнянь, які є наближеними. Як наслідок, відомі на сьогодні моделі опису лі- зоциму³⁴ нездатні одночасно відтворювати структуру та фазову поведінку.

30 C. Ishimoto and T. Tanaka, Phys. Rev. Lett. 39, 474 (1977), ibid.

31 G. Pellicane, D. Costa, and C. Caccamo, J. Phys.: Condens. Matter 15, 375 (2003), G. Pellicane, D. Costa, and C.

Caccamo, The Journal of Physical Chemistry B 108, 7538 (2004).

32 G. Pellicane, J. Phys. Chem. B 116, 2114 (2012).

33 M. C. Abramo, C. Caccamo, M. Cavero, D. Costa, G. Pellicane, R. Ruberto, and U. Wanderlingh, J. Chem. Phys. 139, 054904 (2013), T. Sumi, H. Imamura, T. Morita, Y. Isogai, and K. Nishikawa, Phys. Chem. Chem. Phys. 16, 25492 (2014).

34 M. C. Abramo, C. Caccamo, M. Cavero, D. Costa, G. Pellicane, R. Ruberto, and U. Wanderlingh, J. Chem. Phys. 139, 054904 (2013), T. W. Rosch and J. R. Errington, The Journal of Physical Chemistry B 111, 12591 (2007), F. Carlsson, M.

В дисертаційній роботі отримано потенціал взаємодії для лізоциму з ек- спериментального структурного фак- тора, не вдаючись до жодних набли- жень. Для цього застосовано метод інверсії Больцмана в поєднанні з мето- дом молекулярної динаміки. Викорис- тано ітераційний алгоритм:³⁵



 



− 

+ =

) (

) log (

) ( )

1(

r g

r T g

k r v r v

l R B

l s

l s

l λ

,

(1)

де - потенціал на етапі l, - відповідна парна функція розподілу, а - експериментальна базова фун- кція розподілу. Тут k_B - стала Больц- мана, T - температура, а параметр λ_l

застосовується для досягнення бажа- ної швидкості збіжності. Узгодження між експериментальною функцією ро- зподілу та g(r), отриманою у

моделюванні MD, можна оцінити з Рис. 1. Ці два набори даних у масштабі рисунка розділити неможливо. Те саме стосується і порівняння експериментальних та теоре- тичних структурних факторів S(k), зображених на тому ж рисунку.

Отриманий ефективний потенціал має основний мінімум при r=32Å, який вини- кає внаслідок конкуренції між відштовхувальними та притягальними взаємодіями, та хвіст, який швидко затухає до нуля на великих відстанях. Фазова діаграма, отри- мана для цього потенціалу, зображена на Рис. 2. Для порівняння також наведено ек- спериментальні дані Таратути et al,³⁶ з яких видно, що узгодженість між теорією та експериментом є дуже слабкою. Після технічних тестів, спрямованих на з’ясування причин розбіжності, зроблено висновок, що необхідно вдосконалювати модель біл- ка, яка базується на гіпотезі сферичної симетрії потенціалу взаємодії. З цією метою запроваджено нову, несферичну (NS), модель. Вона складається з трьох вузлів вза- ємодії, що знаходяться на відстані L один від одного. Додаткові вузли взаємодіють через такий самий відштовхувальний м’який потенціал, як і частинки в сферичній моделі. Взаємодія між центральними вузлами є притягальною, її параметри отри-

Malmsten, and P. Linse, ibid.105, 12189 (2001).

35 W. Schommers, Phys. Lett. A 43, 157 (1973), W. Schommers, Phys. Rev. A 28, 3599 (1983), A. K. Soper, Chem. Phys.

202, 295 (1996).

36 V. G. Taratuta, A. Holschbach, G. M. Thurston, D. Blankschtein, and G. B. Benedek, J. Phys. Chem. 94, 2140 (1990).

Рисунок 1. Структурні функції розчину лізоциму при pH=6 та температурі

T=298K. Основний графік показує статич- ний структурний фактор S(k): символи – експериментальні дані, суцільна лінія – результати моделювання MD сферичної S- моделі, пунктирна лінія – те саме для нес- феричної NS-моделі. У вставці відображе- ні відповідні парні функції розподілу.

муються з експериментальної функції g(r). Попарну енергію взаємодії несферичних колоїдів можна записати у вигляді:

∑

=

+

=

3

1 ,

) ( ) 9 (

) 1 (

j i

ns ij

r r v r

v r

v , де rij - відстань між вуз- лом взаємодії i першого колоїду та вузлом взаємодії j другого колоїду, r - відстань між центрами частинок, а потенціал отримується з (1) так само, як для поте- нціалу сферичної моделі . Відштовхувальна частина потенціалу отри- мана шляхом розділення на відштовхувальну і притягальну компоненти в точці першого мінімуму. Далі відштовхувальна компонента була зміщена до нуля і замі- нена степеневою функцією. В результаті отримано вираз

n r

r r

v 



 



=σ )

( , де σ=26Å, n=6.6 та v(r) прямує до v^s(r) в границі L →⁰. Фазову діаграму проаналізовано як функцію відстані L, яка є єдиним вільним параметром несферичної моделі. Найкра ще узгодження з експериментом досягається при L = 18Å, для якого критична тем- пература складає T_c =272K. Відповідна фазова діаграма зображена на Рис. 2. Очеви- дно, що нова модель суттєво покращує діаграму в порівнянні зі сферичним предста- вленням. Отже, форма молекули та м’якість міжмолекулярного потенціалу взаємодії є двома суттєвими чинниками, що забезпечують правильний опис мікроскопічної структури та фазової поведінки розчинів лізоциму. Ці висновки допомагають краще зрозуміти, як потрібно моделю-

вати білки в їх природному во- дному середовищі і є суттєвими для теоретичного дослідження різних супра-молекулярних процесів, в яких задіяні білки, зокрема, мережі взаємодій бі- лок-білок або розробки терапії на основі біологічних молекул.

Окрім фазового розшаруван- ня білки можуть утворювати менші за розмірами комплекси – кластери. Як і в простих коло- їдних суспензіях, у білкових ро- зчинах кластери – це різномані- тні мультимери, які утворюють- ся внаслідок самоасоціації коло- їду та перебувають у рівновазі з мономерами. Попередньо вста- новлено, що кластери в колоїд- них розчинах виникають у сис- темах, що взаємодіють через

Рисунок 2. Фазова діаграма розчину лізоциму при рН=6. Показано експериментальні дані, а та- кож результати сферичної та несферичної моде- лей зL = 18Å. Символи – цегустини співісну- вання газоподібних та рідкоподібних фаз, а лінії - екстраполяція, отримана з даних моделювання на основі правила прямолінійного діаметру. Не- сферична модель демонструє суттєве покращен- ня кривої співіснування.

два типи потенціалів, SALR та HCSS. Пер- ший потенціал має короткосяжну притяга- льну частину (short-range attraction SA) та далекосяжну частину (long-range repulsion LR). Другий потенціал має тверде ядро (hard core HC) та м’яке плече (soft shoulder SS).

Для кількісного опису таких систем у дисер- таційній роботі впроваджено модельний по- тенціал, схематично зображений на Рис. 3, та досліджено його за допомогою комп’ютерного моделювання для широкого спектру параметрів. Показано, що новий по- тенціал, який не належить до жодного зі зга- даних відомих класів, також може приводи- ти до утворення рівноважних кластерів.

Конкретно йдеться про потенціал, в якому замість глобального мінімуму, як у схемі SALR, є локальний мінімум (local attraction

LA) з додатньою енергією, який відокремлений від станів з нульовою енергією на великих відстанях бар’єром скінченої величини. Аналіз кластерів, що утворюються таким LALR потенціалом, у порівнянні з іншими вивченими системами, приведено на Рис. 4(a). Тут радіус гірації використовується для того, щоб охарактеризу- вати залежність розміру кластера від кількості його частинок s. Представлені дані отримано для всіх систем при густинах, що знаходься трохи нижче за їхню густину перколяції. Добре видно, що кластери вивчених систем відрізняються за поведінкою в залежності від свого розміру.

Для великих s можна встановити статистику масштабування ~ . Поведін- ка всіх систем, за винятком SALR, задається показником 0.33, як показано для HCSS, що відповідає максимально компактному об’єкту. Для тієї ж системи в межах малих показник збільшується до n = 1.13. Зауважимо, що для лінійного розташу- вання частинок найменших кластерів, димера та тримера, показник n = 1.2. Тому HCSS веде себе як лінійний ланцюг при малих значеннях s. HCLR, LASS та LALR потенціали також демонструють майже лінійне масштабування, але з показником, специфічним для кожної системи. Подібно до моделі HCSS, кластери, що утворю- ються за допомогою цих потенціалів, демонструють перехідну ділянку від лінійного режиму для малих кластерів до компактного ланцюга для великих кластерів. Пере- хід відбувається поступово і в два етапи.

Істотно відмінна поведінка спостерігається для системи SALR. На Рис. 4(b) по- казано для цієї моделі для кількох значень густини . При низьких густинах

Рисунок 3. Схематичне зображен- ня потенціалу, розглянутого в даній роботі. Залежно від вибору парамет- рів можуть бути вивчені різні типи систем м’якої речовини. П’ять конк- ретних форм, що детально дослі- джені, показані як піктограми.

радіус гірації є монотонною функцією кількості частинок. Починаючи з =0.68, по- чинає розвиватися плато, що сигналізує про настання конфігураційної зміни.

При 1.01 залишається незмінним для 3 19, а потім зростає

вдвічі для 23. Легко з’ясувати, що відбувається в точці переходу, вивчаючи фо- рму кластерів. Приклади кластерів для 19, що зустрічаються безпосередньо пе- ред переходом, і 24, що є одразу ж після нього, показані на Рис. 4(b). Малі, або первинні, кластери утворюють компактні і майже сферичні скупчення частинок. Бі- льші кластери складаються з двох (або більше) таких комбінацій. Отже, утворення кластерів відбувається згідно принципу ієрархічної самоорганізації: малі кластери збираються на початкових етапах і надалі служать будівельними блоками для біль- ших кластерів. Цей сценарій пояснює раптове збільшення при певному зна- ченні переходу . В границі великого кластера радіус гірацiї має степеневу залеж- ність з 0.46, що не залежить від густини. Цей показник близький до 0.5, яке спостерігається для ідеальних або гаусових полімерних ланцюгів, у яких відсутні об’ємні взаємодії і дозволяється проникнення частинок одна в одну. Пояснити май- же ідеальну поведінку системи SALR можна тим, що її кластери можуть проникати один в одного через механізм обміну частинками, хоча самі частинки мають виклю- чений об’єм. З тієї ж причини кластери не відчувають стиснення з навколишнього середовища, як HCSS, і залишаються видовженими, порівняно з максимально ком- пактними станами.

Порівняльний аналіз термодинаміки утворення кластерів для усіх трьох схем – LALR, SALR і HCSS – показує, що LALR слугує мостом між двома іншими. Як і в моделі HCCS, потенціали LARL приводять до утворення кластерів за допомогою ентропійного механізму, однак лише за низької загальної густини й лише для неве- ликих кластерів. Зі зростанням густини в системі LALR, як і в її аналозі SALR, ви- никають кластери великих розмірів за допомогою ентальпійного механізму. По-

Рисунок 4. Радіус гірації як функція кількості частинок. Всі потенціали з відповідними густинами (виміряними в умовних одиницях) показано на (a). Дані для SALR показано на (b).

двійна природа моделі LARL проявляється і в її температурній поведінці. Малі кластери в такій системі стають більш стабільними з ростом темпе- ратури, як і в моделі HCSS, а великі кластери – менш стабільні, подібно до моделі SALR.

Третій розділ присвячений процесам згортання білків, що відбуваються за допомогою молекуляр- них шаперонів. Шаперони, такі як комплекс Gro- EL бактерій E. Coli, підтримують згортання білків у несприятливих умовах, надаючи комірку, в якій ново-синтезований білок може бути ізольований.

Молекули АТФ приєднуються до шаперонів і під- тримують їхню роботу внаслідок гідролізу. Чи ві- діграє шаперонова комірка пасивну роль у захисті білка від агрегації, чи активну роль у прискоренні темпів згортання, залишається предметом дискусії.

У цій роботі досліджено роль конфайнменту (про- сторового обмеження) в реакції згорання методом моделювання молекулярної динаміки. Розглянуто

модельний білок типу α/β-сендвіч, який є типовим структурним елементом для суб- стратів системи GroEL/ES, і поміщено його в сферичну гідрофільну комірку, яка імітує внутрішню поверхню комплексу шаперона. Використано модель, в якій амі- нокислотні залишки представлені однією частинкою на позиції альфа вуглецю.

Схематичне зображення використаної моделі показано на Рис. 5. Вплив конфайнме- нту шаперонової комірки на термодинамічні властивості білка досліджувався за до- помогою молекулярної динаміки в широкому спектрі температур, починаючи від підвищених температур, при яких білок переважно розгорнутий, до нижчих темпе- ратур, при яких білок перебуває в природному стані. За умов відсутності комірки, при температурі спостерігається перехід типу колапс, внаслідок якого радіус гі- рації молекули стрімко зменшується. За колапсом слідує наступний структурний перехід, внаслідок якого компактні конформації трансформуються в природний стан. Температуру згортання _! визначено з флуктуацій параметра структурного пе- рекриття χ, який вимірює структурну різницю між даною конформацією та природ- ним станом. Виявилось, що комірка має різний вплив на ці два переходи. Тоді як температура колапсу поступово збільшується внаслідок просторового обмеження, температура згортання залишається майже незмінною.

Час згортання "_# показано на Рис. 6(a) в залежності від температури та радіуса обмежувальної сфери. Криві мають V-подібну форму, що виникає внаслідок силь- ного сповільнення згортання при високих і низьких температурах. При високих те- мпературах статистична вага природної конформації є низькою в порівнянні з кон- формаціями розгорнутого ансамблю, а отже термодинамічний стимул до згортання

Рисунок 5. Природний стан моделі α/β-сендвіча, розгляну- того в даній роботі. Залишки забарвлені відповідно до їх- нього типу: гідрофобні - тем- но-сірі, гідрофільні – світло- сірі, нейтральні – білі.

відсутній. При низьких температурах, з іншого боку, статистична вага природного стану висока, проте в динаміці білка переважають попадання в кінетичні пастки, створені локальними енергетичними мінімумами. Час звільнення з мінімумів а, от- же, час згортання, зростає, коли температура знижується. Ці дві взаємно протилежні сили – термодинамічне тяжіння до природного стану та повільна структурна дина- міка, зумовлена локальними мінімумами, врівноважують один одного при деякій проміжній температурі _$, де білок згортається швидше, ніж при будь-якій іншій температурі.³⁷

З Рис. 6(а) видно, що конфайнмент не змінює V-подібну форму кривої згортання, а також не впливає на мінімальний час згортання. Мінімальна температура згортан- ня _$, з іншого боку, сильно залежить від шаперонової комірки. Коли радіус комір- ки зменшується, _$ монотонно зсувається в бік вищих температур. Із практичної точки зору важливо зрозуміти, як обмеження в порожнині шаперона впливає на час

згортання субстрату при біологічно важливих температурах. Виходячи з поведінки

$ в залежності від радіуса , можна стверджувати, що при температурах _$, конфайнмент приведе до сповільнення згортання незалежно від розміру комірки.

При низьких температурах компактні структури, як правило, домінують над видов- женими конформаціями з високою енергією і білок проводить більшу частину свого часу в пастці в глобулярному, неправильно згорнутому, стані. Конфайнмент нічого не може зробити, щоб перешкодити білку приймати ці компактні неправильно скла- дені конформації, а в деяких випадках навіть може перешкоджати втечі з цих пас-

37 N. D. Socci and J. N. Onuchic, J. Chem. Phys. 101, 1519 (1994), C.-L. Lee, G. Stell, and J. Wang, ibid.118, 959 (2003), M. Cieplak, T. X. Hoang, and M. S. Li, Phys. Rev. Lett. 83, 1684 (1999).

Рисунок 6. Час згортанняα / βмоделі, дослідженоївданій роботі. На (а) пока- зано час згортання як функцію температури % та радіуса комірки . Для порів- няння також зображено криву, отриману за відсутності комірки (bulk). Показано значення трьох характерних температур %_&, %_' та %₍. Видно, що %_' лежить ниж- че %₍.Ті ж дані для моделі зі зменшеним рівнем фрустрації показано на рис. (b).