Одеське обласне бюро судово-медичної експертизи Резюме. Наведені дані про дослідження алельного
поліморфізму 15 автосомних мікросателітних локусів, які складають індивідуалізуючу панель, що широко використовується в судово-медичних молекулярно-
генетичних дослідженнях в Україні, та практичне вико- ристання цієї панелі в судово-медичній практиці.
Ключові слова: алельний поліморфізм, індивідуа- лізуюча панель, мікросателітні локуси, популяція.
Вступ. Можливості, що відкривають молеку- лярно-генетичні технології для вирішення актуаль- них питань судової медицини, вражають та захоп- люють. Тому впровадження молекулярно- генетичного аналізу в роботу судово-медичної слу- жби України, безсумнівно, є одним із найважливі- ших завдань сьогодення. Але практичне впрова- дження в судово-медичну повсякденність методів молекулярно-генетичної біології трапляється з де- якими перешкодами, які заслуговують пильної ува- ги для їх найшвидшого усунення. Так, ініціативне, децентралізоване та безсистемне впровадження судово-медичних молекулярно-генетичних дослі- джень в Україні упродовж двадцяти років призвело до того, що ці методи використовуються в судово- медичній практиці без належного наукового обґру- нтування; зараз у експертній практиці країни пере- важно використовуються дві індивідуалізуючі пане- лі, одна з яких, розроблена в Одеському обласному бюро СМЕ у 2005 році, складається з 13 мікросате- літних локусів, а друга – мультиплексна індивідуа- лізуюча панель «AmpFlSTR®Identifiler» («Applied Biosystems», США).
Втім, етнічна різноманітність населення України є чинником, що примушує задаватися питаннями про ефективність і достовірність лока- лізації використовуваних у світовій практиці ме- тодів молекулярно-генетичних досліджень. Через відсутність систематизованих даних щодо основ- них популяційних та інформаційних (дискримі- наційних) характеристик індивідуалізуючих па- нелей для української популяції експерти викори- стовують для розрахунку ймовірностей середні (консервативні) дані про розподіл частот зустрі- чальності алелей локусів для популяцій Росії, Європи та США, які надаються виробниками реагентів. Внаслідок цього можуть виникати по- милки, пов’язані з переоцінкою або заниженням ідентифікаційної значущості отриманих даних у експертних висновках.
Тому впровадження цього методу в судово- медичну практику конкретної країни, у тому чис- лі України, повинно супроводжуватися комплек- сом науково-дослідницьких, юридичних та еко-
номічних заходів, метою яких є створення відпо- відної бази для обґрунтування та формалізації роботи фахівця з молекулярно-генетичного аналі- зу.
Першим та одним із найважливіших етапів наукового обґрунтування використання будь-якої молекулярно-генетичної індивідуалізуючої сис- теми на основі багатоалельних локусів геному людини для конкретної країни є дослідження алельного поліморфізму локусів, що входять до її складу, у тих популяціях, що проживають на те- риторії країни, з подальшим обчисленням пара- метрів інформативності (інформаційної значущо- сті) цих локусів. Таке дослідження дозволяє ви- значити інформаційну значущість індивідуалізу- ючої системи в цілому, науково обґрунтувати і підвищити доказове значення експертних виснов- ків при проведенні судово-медичних молекуляр- но-генетичних експертиз із метою ідентифікації особи або встановлення біологічної спорідненос- ті. Подібні дослідження ведуться в багатьох краї- нах, зокрема, у Російській Федерації.
На даний час проведено експертну оцінку індивідуалізуючої панелі з 13 монолокусних сис- тем мікросателітних локусів, яка використовуєть- ся у практиці Одеського обласного бюро судово- медичної експертизи [1]. На даний час працівни- ками Одеського обласного бюро СМЕ проводить- ся дослідження алельного поліморфізму 15 авто- сомних мікросателітних локусів, що входять до складу популярної в Україні індивідуалізуючої панелі «AmpFlSTR®Identifiler» («Applied Biosystems», США) [2-4]. Дана індивідуалізуюча мультиплексна панель була розроблена спеціаліс- тами фірми "Applied Biosystems" у 2002 р. для використання в судово-медичних молекулярно- генетичних експертних дослідженнях.
Мета дослідження. Для науково обґрунто- ваного та ефективного використання вищеописа- ної індивідуалізуючої панелі при виконанні судо- во-медичних молекулярно-генетичних експертиз та досліджень необхідним є дослідження алель- ного поліморфізму локусів, які складають цю панель.
Матеріал і методи. Створено банк зразків рідкої крові неспоріднених представників зміша- них популяцій мешканців міст Одеси, Києва, До- нецька, Дніпропетровська і відповідних областей.
Вибірки з 237 неспоріднених представників змі- шаної популяції міста Одеси і Одеської області, з 208 – міста Києва і Київської області, з 311 – міс- та Дніпропетровська і Дніпропетровської області були сформовані із зразків рідкої крові, отрима- них в Одеському обласному, Київському місько- му та Дніпропетровському обласному бюро СМЕ в ході проведення судово-медичних досліджень.
Вибірка з 144 неспоріднених представників змі- шаної популяції міста Донецька і Донецької об- ласті була сформована із зразків крові, отрима- них у науково-дослідному експертно- криміналістичному Центрі МВС України в Доне- цькій області при проведенні судово-медичних молекулярно-генетичних досліджень.
Зразки крові зберігалися з антикоагулянтом (0,5 М розчин ЕДТА, pH 8,0 або 3,8 % розчин цитрату натрію) у холодильнику не більше 2-3 днів за температури +4 °С.
Геномну ДНК виділяли зі зразків рідкої кро- ві за допомогою набору «NucleoSpin®Blood» для виділення геномної ДНК фірми «MACHEREY- NAGEL» (Німеччина) відповідно до рекоменда- цій, які додаються виробниками.
Концентрацію виділеної при використанні набору «NucleoSpin®Blood» ДНК вимірювали флориметрично за допомогою ДНК-флориметра
«Hoefer DyNA Quant™200» («Hoefer Scientific Instruments», США), згідно з інструкцією до при- ладу.
Виділену геномну ДНК типували методом ПЛР за 15 гіперваріабельними мікросателітними локусами, які входять до складу мультиплексної с и с т е м и і н д и в і д у а л і з у ю ч о ї п а н е л і
"AmpFlSTR®Identifiler" ("Applied Biosystems", США). При проведенні ПЛР здійснювали негати- вний і позитивний контроль. Використовували розчини контрольної ДНК, надані виробниками реагентів. Дослідження здійснювали з викорис- танням термоциклерів «GeneAmp® PCR 2720» («Applied Biosystems», США), «РТС-220 DNA Engine Dyad» («Bio-Rad», США) та «MJ Research PTC-200» (США), згідно з наведеними інструкціями.
Проводили автоматичний аналіз продуктів ампліфікації 15 мікросателітних локусів індиві- дуалізуючої панелі і розділення флуоресцентно- мічених ПЛР-фрагментів у чотирьох капілярних матрицях методом капілярного гель- електрофорезу з полімером POP-4TM за допомо- гою автоматичного генетичного аналізатора
«3130-Genetic Analyzer» («Applied Biosystems», США), згідно з наведеними інструкціями.
Статистичний аналіз отриманих результатів проводили з використанням програмних продук- тів PowerStats V12 ("Promega Corporation", USA) [6] і Arlequin ver. 2.000 [5].
Результати дослідження та їх обговорення.
Для кожної досліджуваної популяційної вибірки встановлені частоти зустрічальності алелей локу- сів, які входять до складу вказаної індивідуалізу- ючої панелі. Аналіз алельного поліморфізму вка- заних локусів при дослідженні представників змішаних популяцій показав, що усі локуси є поліморфними. Характер розподілу частот зу- стрічальності алелей не відрізняється від аналогі- чних у світових популяціях та має уні- або бімо- дальний характер.
При проведенні порівняльного аналізу гене- тичного поліморфізму 15 автосомних STR- локусів чотирьох популяційних вибірок не вияв- лено статистично значущих відмінностей розпо- ділу частот алельних варіантів, що дає змогу зро- бити висновки про високу гомогенність популя- ційних вибірок представників змішаних популя- цій мешканців зазначених міст і відповідних об- ластей.
Дані поліморфізму досліджених 15 мікроса- телітних локусів вказують, по-перше, на можли- вість формування змішаного популяційного ма- сиву, що являє собою адекватний зріз із реально існуючої популяційної ситуації в Україні; по- друге, дає змогу використання частотного розпо- ділу змішаного популяційного масиву для розра- хунку ймовірностей при проведенні судово- медичних молекулярно-генетичних експертиз із метою ідентифікації особи та встановлення біо- логічної спорідненості в експертних установах України.
На підставі результатів цього аналізу сфор- мовано об’єднаний популяційний масив України (900 осіб).
Частоти зустрічальності алелей 15 досліджу- ваних STR-локусів, які входять до складу муль- типлексної індивідуалізуючої панелі, в об’єдна- ному популяційному масиві розраховували з ви- користанням програмного продукту PowerStats V12 ("Promega", США). Дані про розподіл алелей наведені в таблиці.
Перевірка на відхилення генотипних частот 15 досліджуваних локусів від РХВ не виявила значного відхилення від рівноважного стану.
Значення Ho та He статистично не відрізня- ються, що підтверджує вірність нульової гіпоте- зи, тобто досліджувана популяційна вибірка від- повідає рівновазі Харді-Вайнберга. Змішана по- пуляція об’єднаного популяційного масиву меш- канців України є збалансованою, її генетична структура не порушена. Аналіз алельного полі- морфізму локусів вказаної індивідуалізуючої па- нелі при дослідженні цього масиву показав, що всі локуси є високополіморфними. Характер роз- поділу частот зустрічальності алелей не відрізня- ється від аналогічних у світових популяціях та має уні- або бімодальний характер. Таким чином, отримані дані можуть використовуватися як ре- ферентна база даних частот зустрічальності але- лей 15 мікросателітних локусів індивідуалізуючої
Таблиця Частотизустрічальностіалеліей 15мікросателітнихлокусівДНКоб’єднаногопопуляційногомасивуУкраїни Алель
Локуси D8S1179D21S11D7S820CSF1POD3S1358ТH01D13S317D16S539D2S1338D19S433vWATPOXD18S51D5S818FGA 4-----+--------- 5-----0,000556-0,000556------- 6--+0,000556-0,23291-----+--- 7--0,0127780,000556-0,1423-----0,001111+0,003889- 80,006111-0,150560,002778-0,103390,147780,015556---0,57-0,003333- 8,3-----+--------- 90,007778-0,141110,04333-0,208450,0733330,094444-+-0,10444+0,054444- 9.3-----0,30739--------- 100,07-0,283330,25889-0,0050030,0577780,057222-0,000556-0,0556560,0061110,067778- 10,2------------+-- 10,3--------------- 110,077222-0,221110,286110,000556+0,372780,26833-0,00444+0,241110,011110,33667- 11.2---------0,000556----- 11.3---+----------- 120,15833-0,150560,326110,000556-0,229440,325-0,0927780,0005560,0255560,0877780,35667- 12.2---------0,001667----- 130,325-0,0366670,0666670,002222-0,0761110,195-0,218890,0016670,0011110,118330,16167- 13.2---------0,020556--+-- 13.3-----+--------- 140,22944-0,0033330,0127780,12056-0,040,042778-0,350560,10611-0,156110,013333- 14.2---------0,021667--+-- 150,097778-0,0005560,0016670,24722-0,0022220,0005560,0011110,162220,10389-0,168330,001667- 15.2----+----0,039444----- 160,026667---0,25444---0,0505560,0394440,20389-0,16222+0,001111 16.1--------------+ 16.2---------0,027788----- 170,001111---0,21722---0,203890,0033330,26556-0,12+0,001111 17.2---------0,006667----+ 18+---0,145---0,095556-0,22667-0,07-0,013333 18.2---------0,007778----+ 190,000556---0,012222---0,11778-0,076667-0,042778-0,089444 19.2--------------+
Таблиця (продовження) 20----+---0,13944-0,013333-0,028333-0,15167 20.2--------------+ 21--------0,033333-0,001667-0,017778-0,185 21.2--------------0,002222 22--------0,018333-+-0,007778-0,19944 22.2--------------0,01 22.3--------------+ 23--------0,092778-+-0,003333-0,12667 23.2--------------0,006111 24-0,001111------0,10056-+-+-0,11944 24.2-+------------0,000556 24.3-+------------- 25-+------0,12278---+-0,070556 25.2-+------------- 26-0,003333------0,020556---+-0,018889 26.2--------------+ 27-0,026667------0,001111---+-0,00333 28-0,15278------0,001111-----0,001111 28.2-+------------- 29-0,22444------------+ 29.2-+------------- 29.3-+------------- 30-0,22667------------+ 30.2-0,064444------------+ 31-0,05333------------- 31.2-0,099444------------+ 32-0,012222------------- 32.2-0,10333------------+ 33-0,000556------------- 33.2-0,026667------------+ 34-+------------- 34.1-+------------- 34.2-0,003333------------+
Рецензент – проф. В.Т. Бачинський Buk. Med. Herald. – 2013. – Vol. 17, № 3 (67), рart 1. – P. 188-192 Надійшла до редакції 08.06.2013 року панелі та аналогічних монолокусних систем для
інформаційно-довідкового забезпечення експерт- ного ДНК-аналізу мешканців України.
Висновки
1. На матеріалі 900 неспоріднених представ- ників змішаної популяції мешканців України створено референтну базу даних частот зустріча- льності алелей 15 автосомних мікросателітних локусів (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, ТНО1, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA), що входять до складу індивідуалізуючої мульти- п л е к с н о ї п а н е л і « A m p F l S T R ® I d e n t i- filer» («Applied Biosystems», США).
2. Дослідження алельного поліморфізму ло- кусів, що складають вказану індивідуалізуючу панель, показало, що для об’єднаного популяцій- ного масиву України характер розподілу частот зустрічальності алелей вказаних локусів дозволяє використовувати встановлені частотні характери- стики досліджуваних локусів індивідуалізуючої панелі як опорні параметри при розрахунках ймо- вірностей у ході судово-медичних молекулярно- генетичних експертиз з метою ідентифікації осо- би та встановлення біологічної спорідненості в експертній практиці України.
3. Для підвищення доказового значення та ступеня наукової обґрунтованості експертних висновків при обчисленні ймовірностей у ході проведення судово-медичних молекулярно- генетичних експертиз із метою ідентифікації осо- би та встановлення біологічної спорідненості
доцільно використовувати значення частот зу- стрічальності алелей вибірки об’єднаного попу- ляційного масиву України, що дозволяє найбільш адекватно оцінити результати ДНК-аналізу саме для української популяції.
Література
1. Яворський Б. І. Експертна оцінка індивідуалізуючої панелі 13 монолокусних систем мікросателітних локу- сів, яка використовується у практиці Одеського облас- ного бюро судово-медичної експертизи / Б.І. Явор- ський // Укр. мед. альманах. – 2012. – Т. 15, № 4. – С. 104-107.
2. Яворський Б. І. Варіабельність 15 автосомних мікро- сателітних локусів геномної ДНК у змішаній популя- ції мешканців Одеського регіону / Б.І. Яворський //
Інтегративна антропологія. – 2009. – № 2 (14). – С. 12-17.
3. Яворський Б.І. Варіабельність 15 автосомних мікроса- телітних локусів геномної ДНК у змішаній популяції мешканців Київського регіону // Зб. наук. праць спів- робітників НМАПО імені П.Л. Шупіка. – 2010. – Ви- пуск 19, книга 3. – С. 469-477.
4. Яворський Б.І. Варіабельність 15 автосомних мікроса- телітних локусів геномної ДНК у змішаній популяції мешканців Донецького регіону / Б.І. Яворський, І.Г. Долгих // Укр. мед. альманах. – 2011. – Т. 14,
№ 1. – С. 228-231.
5. Schneider S. Arlequin ver. 2.000: A software for population genetic data analysis / S. Schneider, D. Roessli, L. Escoffier // University of Geneva, Switzerland: Genetic and Biometry Laboratory, 2000. – Р. 212-217.
6. Tereba A. Tools for Analysis of Population Statistics / A. Tereba // Profiles in DNA. – 1999. – Vol. 2, Promega Corporation. – Mode of access: http://www.promega.com/
geneticidtools/powerstats/
ИССЛЕДОВАНИЕ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА 15 АВТОСОМНЫХ
МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ, КОТОРЫЕ ВХОДЯТ В СОСТАВ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ИНДИВИДУАЛИЗИРУЮЩЕЙ ПАНЕЛИ «AMPFLSTR®IDENTIFILER» («APPLIED
BIOSYSTEMS», США), В СМЕШАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ЖИТЕЛЕЙ НЕКОТОРЫХ РЕГИОНОВ УКРАИНЫ
Б.И. Яворский, Р.Г. Кривда
Резюме. Приведены данные об исследовании аллельного полиморфизма 15 автосомных микросателлитных локусов, составляющих индивидуализирующую панель, которая широко используется в судебно-медицинских молекулярно-генетических исследованиях в Украине.
Ключевые слова: аллельный полиморфизм, индивидуализирующая панель, микросателлитные локусы, попу- ляция.
INVESTIGATION OF ALLELІС POLYMORPHISM OF 15 AUTOSOMAL MICROSATELLITE LOCI, FORMING THE MULTIPLEX INDIVIDUALIZED SYSTEM FOR PCR-AMPLIFICATION "AMPFLSTR®IDENTIFILER" ("APPLIED BIOSYSTEMS", USA),
IN MIXED POPULATIONS OF INHABITANTS OF SOME REGIONS OF UKRAINE B.I. Yavorskyi, R.G. Kryvda
Abstract. We present data about an investigation of allelic polymorphism of 15 autosomal microsatellite, making up an individualizing panel that is widely used in forensic medical molecular-genetic researches in Ukraine.
Key words: allelic polymorphism, individualizing panel, STR loci, population.
Regional Bureau of Forensic Medical Examination (Odessa)
© Б.І. Яворський, Р.Г. Кривда, 2013