• No results found

Одеський національний медичний університет Резюме. У роботі показана можливість викорис-

тання гістологічних препаратів, як біологічні зразки, при проведенні судово-медичних молекулярно- генетичних експертиз із метою ідентифікації особи та

встановлення біологічної спорідненості (батьківства, материнства).

Ключові слова: геномна ДНК, гістологічні препа- рати, ПЛР, ідентифікація особи, біологічна спорідне- ність.

© Р.Г. Кривда, І.В. Ланцман, 2013

Вступ. Основними завданнями судово- медичної молекулярно-генетичної експертизи є ідентифікація особи та встановлення біологічної спорідненості.

Принцип проведення судово-медичної моле- кулярно-генетичної експертизи полягає в порів- няльному аналізі профілів геномної ДНК, виділе- ної з будь-яких біологічних тканин. У судово- медичній практиці часто виникають експертні задачі, вирішення яких можливе лише за рахунок дослідження гістологічного матеріалу від живих або померлих осіб. Наприклад, у випадках необ- хідності встановлення належності гістологічних біопсійних препаратів конкретній особі, або за необхідності встановлення біологічної спорідне- ності, якщо передбачуваний батько (мати) помер- ли і єдиним придатним для проведення судово- медичного молекулярно-генетичного експертно- го дослідження біологічним матеріалом можуть бути гістологічні препарати [1].

Дослідження складається з наступних етапів:

виділення геномної ДНК з біологічного матеріа- лу, ампліфікація та подальший аналіз гіперваріа- бельних ділянок ДНК, специфічних для кожного індивідуума.

Висока чутливість полімеразної ланцюгової реакції висуває певні вимоги щодо правил відбо- ру об’єктів і екстракції ДНК з «архівного» біоло- гічного матеріалу – гістологічних препаратів.

Необхідно індивідуально добирати відповідну методику дослідження залежно від виду гістоло- гічного об’єкта та його стану [2, 3].

Мета дослідження. Визначити можливості використання гістологічних препаратів тканин, відібраних під час біопсій, а також препаратів біологічних тканин, що відбиралися при патоло- го-анатомічних дослідженнях трупів, як біологіч- ні зразки, при проведенні судово-медичних моле- кулярно-генетичних експертиз із метою ідентифі- кації особи та встановлення біологічної спорідне- ності (батьківства, материнства).

Матеріал і методи. Як об’єкти для експери- ментального дослідження протестовано чотири групи випадково відібраних гістологічних препа- ратів, які позначали відповідно І, ІІ, ІІІ, ІV. До І групи входили біологічні тканини пухлинного походження в парафінових блоках, відібрані під час біопсій (n=42), до ІІ групи – біологічні ткани- ни пухлинного походження на предметних скель- цях, відібрані під час біопсій (n=42), ІІІ групу

Таблиця 1 Кількість ДНК, виділеної із об’єктів дослідження, нг/мкл

Групи об’єктів

дослідження Середнє значення, М Мінімальне значення Максимальне значення

І (n=42) 21,0 8,8 43,0

ІІ (n=42) 1,3 0,83 4,0

ІІІ (n=60) 2,3 2,9 5,8

ІV (n=29) 1,2 2,1 3,9

складали біологічні тканини у вигляді «вологого»

архіву автопсійного матеріалу (n=60), ІV група складалася з біологічних тканин автопсійного матеріалу в парафінових блоках (n=29). При до- слідженні була відсутня інформація щодо виду тканини, часу з моменту проведення біопсій та автопсій, часу фіксації тканин у формаліні та йо- го концентрації.

Геномну ДНК виділяли із 10-15 мг біологіч- ної тканини гістологічних препаратів за допомо- гою набору реагентів «PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction Kit» (Applied Biosystems", США).

Виділену ДНК фракціонували методом гори- зонтального «підводного» електрофорезу в елект- рофорезній камері «Hoefer Scientific Instru- ments» (США). Електрофорез здійснювали протя- гом 1 години при напрузі постійного струму 70 В у 1хТВЕ буфері (50 мМ трис- Н3ВО3, 2 мМ Na3ЕДТА, рН 8,0) в 1 % агарозному гелі з дода- ванням бромистого етидію до кінцевої концент- рації 0,5 мкг/мл.

Концентрацію виділеної геномної ДНК вимі- рювали за допомогою флуориметра Qubit® 2.0 (Invitrogen/Life Technologies, США) з викорис- танням набору реагентів Qubit® dsDNA BR для кількісного визначення дволанцюгової ДНК.

ДНК, виділену із біологічної тканини гісто- логічних препаратів, досліджували за допомогою н а б о р у д л я П Л Р-а м п л і ф і к а ц і ї

"AmpFlSTR®Identifiler Plus" (Applied Biosystems", США), з терміном придатності не менш ніж дев’ять місяців, відповідно до інструк- ції, яка додається виробниками реагентів. При постановці ПЛР здійснювали негативний і пози- тивний контроль. Дослідження проводили з вико- ристанням системи «GeneAmp® PCR 2720» ("Applied Biosystems", США). Розділення продуктів ампліфікації проводили з використан- ням пристрою 3130 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США). Аналіз продуктів ампліфіка-

ції з встановленням алелів проводили за допомо- гою програми «Gene Mapper ID Software Version 3.1».

Результати дослідження та їх обговорення.

У цілому, при визначенні кількості ДНК, виділе- ної з І групи біологічних тканин, спостерігалися достатньо високі показники концентрації екстра- гованої ДНК (у середньому 21,0 нг/мкл), для ІІ і ІV груп гістологічних препаратів спостерігалося зменшення концентрацій виділеної ДНК, у серед- ньому, до 1,5 нг/мкл та 1,2 нг/мкл відповідно. В умовах проведеного дослідження для ІІІ групи об’єктів виявилося можливим виділити ДНК у середній концентрації 2,3 нг/мкл. Дані про кіль- кість ДНК, виділеної з об’єктів дослідження, на- ведені в табл. 1.

Результати електрофоретичного розподілу в 1 % агарозному гелі ДНК, виділеної з об’єктів груп І і ІІ показали, що ДНК, виділена з усіх досліджува- них об’єктів, характеризується як деградована (з довжиною фрагментів від 9000,0 до 200,0 п. н.) зі збереженням фракції високомолекулярних фрагме- нтів, що дає змогу в подальшому успішно ампліфі- кувати зазначену ДНК. У той же час для групи ІІІ виділена ДНК має виражені ознаки високого ступе- ня деградації (з довжиною фрагментів до 100,0 п.

н.), що свідчить про її непридатність для проведен- ня ПЛР. Довжина фрагментів виділеної ДНК об’єк- тів ІV групи складала до 250,0 п. н.

Для оцінки придатності виділеної з об’єктів ДНК проводили її ПЛР-типування за допомогою н а б о р у д л я П Л Р-а м п л і ф і к а ц і ї

"AmpFlSTR®Identifiler Plus" (Applied Biosystems", США). Результати типування наведено в табл. 2.

У результаті типування виділеної ДНК біо- логічних тканин І групи стійкі та відтворювані профілі ДНК одержані для 40 об’єктів з 42, що становило 95,0 % успішного генотипування екст- рагованої ДНК. Для ІІ групи профілі ДНК були одержані у 37 випадках з 42, що становило

Таблиця 2 Кількість та відсоток ДНК-профілів, одержаних при дослідженні біологічних тканин

об’єктів І, II, III та IV груп

Групи об’єктів дослідження Кількість, n Відсоток, %

І (n=42) 40 95,0

ІІ (n=42) 37 88,0

ІІІ (n=60) - -

ІV (n=29) 2 7,0

Рецензент – проф. В.Т. Бачинський Buk. Med. Herald. – 2013. – Vol. 17, № 3 (67), рart 1. – P. 83-85 Надійшла до редакції 07.06.2013 року

© Р.Г. Кривда, І.В. Ланцман, 2013

88,0 %, для IV групи ампліфіковано два профілі з 29, що відповідає 7,0 % позитивного типування.

Слід зазначити, що для ІІІ групи об’єктів, в умо- вах даного експерименту із застосуванням наяв- ного обладнання та реагентів, одержати продукти ампліфікації виділеної ДНК не виявилося можли- вим, що підтверджується результатами електро- форезу в агарозному гелі та проведенням кількіс- ної оцінки екстрагованої ДНК.

У першу чергу, це пов’язано з високим сту- пенем деградації молекул ДНК об’єктів ІІІ групи, яка виражається у вигляді окиснення, дезаміну- вання і депуринізації, розривами як однієї, так і двох ланцюгів дуплексу ДНК, пов’язаною з дією формаліну при тривалій експозиції.

Висновок

Таким чином, результати даного досліджен- ня показали, що найбільш придатними для прове- дення судово-медичної молекулярно-генетичної експертизи, як зразки з метою ідентифікації осо- би та встановлення біологічної спорідненості, виявилися біологічні тканини пухлинного похо-

дження, відібрані під час біопсій у вигляді пара- фінових блоків та на предметних скельцях.

Перспективи подальших досліджень. Ак- туальним є подальше молекулярно-генетичне дослідження гістологічних препаратів з ураху- ванням впливу різних методів фіксації біологіч- них тканин на стан та якість ДНК.

Література

1. Орлова О.А. Використання гістологічних препаратів при проведенні судово-медичних молекулярно- генетичних експертиз із метою ідентифікації особи і встановлення біологічного батьківства (материнства) / О.А. Орлова, І.В. Ланцман // Сучасні теоретичні та практичні аспекти клінічної медицини: науково- практична конференція з міжнародною участю, 19-20 квіт. 2012 р., Одеса: тези доп. – Одеса, 2012. – С. 34.

2. Pilot study of DNA extraction from archival unstained bone marrow slides comparison of three rapid methods / M.A. Gari, A.M. Abuzenadah, A.G. Chaudhary [et al.] //

African J. of Biotechnology. – 2006. – Vol. 5, № 6. – P. 532-535.

3. Extraction of genomic DNA from formalin fixed tissues of different wild avian species / K. Shrivastava, M.S. Thakur, M.P.S. Tomar [et al.] // Annals of Biological Research. – 2012. – Vol. 3, № 7. – P. 3174-3175.

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК, ВЫДЕЛЕННОЙ ИЗ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКИХ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭКСПЕРТИЗ Р.Г. Кривда, И.В. Ланцман

Резюме. В работе показана возможность использования гистологических препаратов в качестве биологиче- ских образцов при проведении судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз с целью идентифика- ции личности и установления биологического родства (отцовства, материнства).

Ключевые слова: геномная ДНК, гистологические препараты, ПЦР, идентификация личности, биологиче- ское родство.

INVESTIGATION OF GENOMIC DNA, EXTRACTED FROM HISTOLOGICAL PREPARATIONS, FOR CONDUCTING FORENSIC-MEDICAL

MOLECULAR-GENETIC EXAMINATIONS R.H. Kryvda, I.V. Lantsman

Abstract. In this paper we have demonstrate a possibility of the application of histologic specimens as biological sam- ples in the process of performing forensic medical molecular-genetic examinations of the personality identification and establishing the biological relationship (paternity, maternity).

Key words: genomic DNA, histological preparations, PCR, personality identification, biological relationship.

National Medical University (Odesa)

© Г.Ф. Кривда, Д.О. Уманський, Р.Г. Кривда, 2013

УДК 340.6:616-076:577.21

Г.Ф. Кривда, Д.О. Уманський, Р.Г. Кривда

ЦИТОЛОГІЧНИЙ ПРЕПАРАТ – ДЖЕРЕЛО ГЕНЕТИЧНОЇ

Outline

СУПУТНІ ДОКУМЕНТИ