• No results found

© М.А. Савченко, Г.П. Петюнін, 2013

УДК 615.214.24:543.062.061

1М.А. Савченко, 2Г.П. Петюнін

ДОСЛІДЖЕННЯ ПОВЕДІНКИ ГІДАЗЕПАМУ ТА ЙОГО

жектора – 250 0С, інтерфейса масспектрометра (Transfer line ) – 280 0С, джерела іонів – 230 0С, квадруполя – 1500С. Режим іонізації – електро- нний удар, енергія електронів – 70еВ, діапазон сканування 40 – 700 а.о.м., поріг – 110, швидкість сканування – 4,11 скан/с. Режим програмування температури термостата: 70 0С – 2 хв, потім під- йом до 210 0С зі швидкістю – 45 0С/хв, потім під- йом до 320 0С зі швидкістю – 15 0С/хв, та витри- мування при цій температурі 7.56хв. Тиск газу – носія(гелію) на вході в першу колонку – 26,06 psi, другу – 19.30 psi. Режим вводу проби: 1мкл за допомогою автосамплера серії 7683 без поділу потоку. До інжекції мікропотоковий перемикач вимкнено (потік газу носію проходить через пер- шу колонку ), перемикання потоку з першої коло- нки на другу через 7.50 хв після інжекції та пове- рнення в початковий стан після закінчення хро- матографування. Аналіз та ідентифікацію мас- спектральних даних проводили за допомогою бази пошукового комплексу NIST11 із викорис- танням підпрограмами аналізу масхроматограм AMDIS v.2.70.

Після хроматомасспектрометричного дослі- дження метанольні екстракти упарювались та додатково перевірялися на наявність залишків нативного гідазепаму ТШХ у системі етилацетат:

метанол: 25 % NH3 (17:2:1). Довжина фронту роз- чинників 8см, проявлення р. Драгендорфа.

Амінобензофенони виділяли з гідролізату гідазепаму (10мл) шляхом потрійної екстракції CHCl3 (5мл) після доведення кислотності до рН 2-3 20 % NaOH за наявності 2мл 2М K2HPO4. Об’єднані органічні екстракти фільтрували крізь паперовий фільтр із 3г зневодненого Na2SO4 та випаровували під розрядженням водоструменево- го насоса при 40 0С. Хроматографічне розділення в тонкому шарі сорбенту проводили в системах:

№ 1 – бензол, № 2 – толуол, фронт розчинника – 8 см. Проявлення плям амінобензофенонів на пластинках проводили за власним забарвленням та за реакцією Браттона-Маршaлла після фотолі- тичного дезалкілювання [9, 10]. З метою іденти- фікації індивідуальних бензофенонів, плями останніх змивали із сорбенту 5мл етанолу, який

упарювали під розрядженням водоструменевого насоса при 40 0С. Сухі залишки метилювали діа- зометаном, розчиняли в 0,5 мл метанолу та дослі- джували методом хроматомасспектрометрії.

Гідроліз сечі (10мл) проводили в співвідно- шенні об’єкт-концентрована хлорводнева кисло- та 3: 2 упродовж 90 хв. Виділення з гідролізату амінобензофенонів, хроматографію в тонкому шарі сорбенту та хроматомасспектрометричне підтвердження проводили аналогічно наведеній процедурі при гідролізі гідазепаму.

Екстракцію нативної сечі (1 мл) проводили двічі 3мл CHCl3 після доведення кислотності до рН 2-3 1М HCl за наявності 50мкл 2М K2HPO4. Органічні екстракти об’єднували, фільтрували крізь 0.5г зневодненого Na2SO4 та упарювали під розрядженням водоструменевого насоса при 400С. Отриманий екстракт метилювали діазоме- таном, після чого розчиняли в 50мкл метанолу та досліджували на хроматомасспектрометрі. Пара- лельно другий екстракт, отриманий з іншої порції сечі за аналогічною схемою, дериватизували за допомогою 50мкл BSTFA [9].

Ферментативний гідроліз сечі (1мл) прово- дили згідно з [9], подальша екстракція проводи- лася за схемою як для нативної сечі, але без дода- вання розчину K2HPO4. Кінцевий екстракт дери- ватизували 50мкл BSTFA.

Результати дослідження та їх обговорення.

Виходячи із структури гідазепаму(1), можна при- пустити наступну схему гідролізу: на першому етапі відбувається гідроліз гідразокарбонільної групи, з утворенням карбоксильної групи, на дру- гому етапі власне гідроліз діазепінового циклу з утворенням амінокарбоксиметилбромбензо- фенону [2, 9, 10]. На практиці, дійсно, на початку гідролізу виявляється продукт гідролізу гідразо- карбонільного фрагмента – карбоксигідазепам (2), разом із очікуваним амінокарбоксиметилб- ромбензофеноном АКББ (4), при цьому кількість останнього збільшуеться одночасно із зменшен- ням карбоксигідазепаму. Несподіваним вияви- лась наявність двох інших бензофенонів – аміно- бромбензофенону (АББ (5)) та метиламінобром- бензофенону (МББ (6)), утворення яких можна

N O

Br N N H O

NH2

N O

N O

Br

OH

NH O

Br N

NH

O O

Br

OH

NH

Br O

NH2

Br O гідроліз

Н+

дезалкілювання H+

-CO2

1

2

3

4

5

6

Схема 1. Гідроліз гідазепаму

Таблиця 1 Кількістьпродуктівзалежновідчасугідролізутакількостікислотугідролізаті Співвідношенняводитаконцентрованоїкислоти 9 : 14 : 17 : 3 часгідролізу, хв 153045607590105120153045607590105120153045607590105120 кількістьпродуктугідролізу, % карбоксиметилгідазепамкарбоксиметилгідазепамкарбоксиметилгідазепам 541544н/зн/зн/зн/з201233н/зн/зн/зн/з3729191514941 АКББАКББАКББ 4675811464н/зн/з7179286н/зн/зн/зн/з5644393430191310 АББАББАББ н/з1015434952647799325171768384718232935515357 МББМББМББ н/зн/зсл101191012н/зсл4989911н/ з56568109 3-феніл-5-броміндол3-феніл-5-броміндол3-феніл-5-броміндол н/зн/зн/з2934352611н/зн/ з3331211685н/ з4131715131923

Таблиця 1 (продовження) Співвідношення води та концентрованої кислоти

3:2 1:1

час гідролізу, хв

15 30 45 60 75 90 105 120 15 30 45 60 75 90 105 120

кількість продукту гідролізу, %

карбоксиметилгідазепам карбоксиметилгідазепам

57 48 41 30 22 15 14 15 80 65 59 56 52 46 34 25

АКББ АКББ

35 45 38 35 26 22 21 19 16 32 37 38 40 44 48 55

АББ АББ

8 6 18 31 45 55 58 59 3 3 4 6 7 8 13 17

МББ МББ

н/з н/з 3 4 7 8 8 7 н/з н/з н/з н/з 1 2 5 3

3-феніл-5-броміндол 3-феніл-5-броміндол

н/з н/з сл сл сл сл сл сл н/з н/з н/з сл сл сл сл сл

Примітка. н/з – речовину не виявлено, сл – слідові кількості (менше 1 %)

Таблиця 2 Хроматографічна рухливість амінобензофенонів

Амінобензофенон

Система №1

hRf Система №2

hRf (середнє з 5 вимірювань)

АББ 45 50

АХБ 45 50

МББ 75 67

МХБ 75 67

АКББ 0 0

Схема 2. Утворення 3-феніл-5-броміндолу

N H O

O OH Br

N H

Br -H

2

O

-CO

2

пояснити із процесами N1-дезалкілювання та де- карбоксилювання, які проходять одночасно із гідролізом. Відсутність в екстрактах N1- дезалкілгідазепаму(3) дозволяє припустити, що амінобензофенони (5) та (6) походять безпосеред- ньо від АКББ (схема 1). Підтвердженням остан- ньої думки є результат гідролізу окремо АКББ упродовж 90хв ( співвідношення концентрована хлорводнева кислота – вода 3:7). При подальшо- му хроматомасспектрометричному дослідженні в гідролізаті дійсно разом із АКББ, було ідентифі- ковано АББ та МББ. Крім згаданих амінобензо- фенонів, серед продуктів гідролізу як гідазепаму, так і АКББ, нами виявлено речовину, масспектр якої, згідно з бібліотечним пошуком, ідентичний

масспектру 2-(4-бромфеніл)індолу ( CAS# 6127- 49-7), але виходячи із структури АКББ, виявлена речовина імовірно є його продуктом одночасного декарбоксилювання та циклізації – 3-феніл-5- броміндол (схема 2). Нативний гідазепам у жод- ній пробі не виявлено.

Співвідношення продуктів гідролізу гідазе- паму суттєво залежить від часу та концентрації кислоти (табл. 1).

Так, із збільшенням часу гідролізу, при спів- відношені дистильована вода – концентрована кислота 9:1 та 4:1, глибина гідролізу логічно збі- льшується і через 75-105 хв наявні лише кінцеві продукти гідролізу АББ, МББ та 3-феніл-5- броміндол, при цьому кількість АББ та МББ збі-

льшується, а кількість 3-феніл-5-броміндолу зме- ншується із одночасним зменшенням АКББ. При співвідношенні вода – концентрована кислота 7:3 навпаки, при збільшенні кількості АББ, збільшу- ється і кількість 3-феніл-5-броміндолу, при цьому збільшення кількості МББ незначне. Із подаль- шим збільшенням концентрації кислоти спостері- гається практично повне припинення утворення 3-феніл-5-броміндолу, (при співвідношенні вода - концентрована кислота 3:2 та 1:1 лише слідові кількості), але сам гідроліз проходить не повніс- тю. Навіть після двох годин лишається певна кі- лькість карбоксигідазепаму.

У результаті кислотного гідролізу сечі як і очікувалось, було ідентифіковано всі три аміно- бензофенони. Враховуючи інтенсивний метабо- лізм гідазепаму [1, 3, 5, 7], наявність амінобром- бензофенону (5) повністю очікувана і може бути пов’язана з наявністю метаболіту гідазепаму N1 – дезалкілгідазепаму, який як і аналогічні похідні 1.4-бенздіазепіну, при кислотному гідролізі утво- рює амінобензофенон [2, 9, 10]. Наявність АКББ стало зрозумілим після хроматомасспектромет- ричного дослідження нативної сечі. Разом із опи- саним у роботах [3, 5] N1 – дезалкілгідазепамом, у сечі людини нами було виявлено, у вигляді три- метилсилільного похідного та метилового ефіру, карбоксигідазепам, а після ферментативного гід- ролізу сечі, у вигляді триметилсилільного похід- ного, ще й 3-гідрокси-N1-дезалкілгідазепам, який знаходиться в сечі практично повністю у вигляді глюкуроніду, та при гідролізі теж утворює АББ [2, 9, 10]. Таким чином, походження амінобензо- фенонів при кислотному гідролізі сечі пов’язане як за рахунок відповідних метаболітів, так і за рахунок перетворень АКББ.

Особливості амінобензофенонів гідазепаму проявляються і при використанні класичної схе- ми “скринінгу” на похідні 1.4-бенздіазепіну по амінобензофенонам [9, 10]. Так, при застосуванні ТШХ у системі № 1 та № 2 хроматографічна рух- ливість АББ та МББ ідентична відповідним амі- нохлорбензофенону (АХБ) та метиламінохлор- бензофенону (МХБ), що в цьому випадку призво- дить до труднощів в ідентифікації цих амінобен- зофенонів, при цьому АКББ залишається на лінії старту (табл. 2).

Крім того, всі три амінобензофенони, як всі інші, проявляються р. Браттона – Маршалла (відповідно АКББ та МББ після фотолітичного дезалкілювання [9,10]).

Висновок

1. У результаті проведеної роботи встановле- но, що в процесі гідролізу, для гідазепаму харак- терно утворення трьох амінобензофенонів – амі- нобром-бензофенону, амінокарбоксиметилбром- бензофенону, метиламінобромбензофенону та 3- феніл-5-броміндолу, що зумовлено проходжен- ням паралельно із гідролізом процесів дезалкілю- вання, декарбоксилювання та циклізації. При цьому найбільш характерним амінобензофено- ном для гідазепаму є АКББ. Разом з тим співвід-

ношення продуктів гідролізу, а відповідно і домі- нування напрямку реакції, залежить від концент- рації кислоти в гідролізаті та часу гідролізу. Від- повідно до останньої умови, класична схема гід- ролізу [9], де гідроліз триває 30хв при співвідно- шенні об’єкт-концентрована кислота 1:1, буде не ефективна у випадку гідазепаму.

2. Наявність амінобромбензофенону, метил- амінобромбензофенону та амінокарбоксиметил- бромбензофенону, в гідролізаті сечі зумовлена наявністю головних метаболітів гідазепаму: кар- боксиметилгідазепаму, N1 – дезалкілгідазепаму та 3-гідрокси-N1-дезалкілгідазепаму.

3. При загальному напрямку тонкошарової хроматографії скринінгу по амінобензофенонах, амінобромбензофенону та метиламінобромбензо- фенону поводять себе аналогічно амінохлорбен- зофенону та метиламінохлорбензофенону і мо- жуть бути помилково віднесені до них, при цьо- му амінокарбоксиметилбромбензофенон не від- кривається.

4. Враховуючи хімічну природу амінокарбо- ксиметилбромбензофенону, схема екстракції амі- нобензофенонів з лужного середовища, при ці- льовому скринінгу на похідні 1,4-бензодіазепіни, призведе до не відкриття амінокарбоксиметил- бромбензофенону, що разом із хроматографіч- ною подібністю амінобромбензофенону та метил- амінобромбензофенону з амінохлорбензофенону та метиламінохлорбензофенону може призвести до хибного висновку та не відкриття гідазепаму або його метаболітів.

Перспективи подальшого дослідження.

Вперше вивчено поведінку гідазепаму та його метаболітів в умовах загального скринінгу на похідні 1,4-бензодіазепіну по амінобензофено- нах. Виходячи із результатів дослідження, необ- хідним є подальше удосконалення методів скри- нінгу та ідентифікації даного препарату та його метаболітів.

Література

1. Биотрансформация и фармакокинетика гидазепама у крыс / Г.Б. Колыванов, В.П. Жердев, А.П. Родионов [и др.] // Хим.-фармац. ж. – 1993. – Т. 27, № 1. – С. 16-19.

2. Богатский А.В. Транквилизаторы (1,4-бенздиазепины и родственные Акционерное общество "Макрохим"

структуры) / А.В. Богатский, С.А. Андронати, Н.Я. Головенко. – К.: Наук. думка, 1980. – С. 116-121, 219-227, 252.

3. Гидазепам / [Андронати С.А., Воронина Т.А., Голове- нко Н.Я.и др.]; отв.ред. Андронати С.А.; АН Украины.

Физико-хим. ин-т им А.В. Богатского. – К.: Наук.

думка, 1992. – С. 15-16, 50-52, 70-75, 63-75, 120-131.

4. Жук О.В. Гидазепам – новый отечественный дневной транквилизатор / О.В. Жук, В.А. Карпинчик. – Прови- зор, 2000. – № 17. – С. 33-35.

5. Колыванов Г.Б. Биотрансформация и фармакокинети- ка гидазепама у животных разных видов и человека / Г.Б. Колыванов, В.П. Жердев // Эксперим. и клин.

фарамакол. – 1993. – Т. 56, № 3. – С. 48-50.

6. Методы определения микроколичеств пестицидов / Под ред. М.А. Клисенко. Совместное издание СССP- НРБ-ГДР-ВНР-ЧССР-СФРЮ. – М.: Медицина, 1984. – С. 206-207.

УДК 340.6:616-005.1-073.7

М.С. Саенко, П.А. Каплуновский

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДАВНОСТИ КРОВОПОДТЕКОВ И КРОВОИЗЛИЯНИЙ

Outline

СУПУТНІ ДОКУМЕНТИ