МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ УКРАЇНИ
“КИЇВСЬКИЙ ПОЛІТЕХНІЧНИЙ ІНСТИТУТ ІМЕНІ ІГОРЯ СІКОРСЬКОГО”
Факультет біомедичної інженерії Кафедра біомедичної інженерії
До захисту допущено:
Завідувач кафедри
________ Владислав ШЛИКОВ «___»_____________2021р.
Дипломна робота
на здобуття ступеня бакалавра
за освітньо-професійною програмою « Біомедичні прилади та інформаційно-вимірювальні системи »
спеціальності 152 « Метрологія та інформаційно-вимірювальна техніка » на тему: « 4Рі мікроскоп для дослідження біологічних середовищ »
Виконав:
студент IV курсу, групи БП-71 Полуектов Сергій Олександрович
(підпис)
Керівник:
ст.викл. каф. БМІ Савкіна Катерина Олександрівна
(підпис)
Консультант з дипломного проектування:
д.т.н. доцент, професор каф. ВП Безуглий Михайло Олександрович
(підпис)
Консультант з розділу «Охорона праці»:
к.т.н. доцент каф. ОПЦБ Демчук Гліб Вікторович
(підпис)
Рецензент:
д.мед.н., проф.,завідувач кафедри, Худецький Ігор Юліанович
(підпис)
Засвідчую, що у цій дипломній роботі немає запозичень з праць інших авторів без відповідних посилань.
Студент __________
НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ УКРАЇНИ
“КИЇВСЬКИЙ ПОЛІТЕХНІЧНИЙ ІНСТИТУТ ІМЕНІ ІГОРЯ СІКОРСЬКОГО”
Факультет біомедичної інженерії Кафедра біомедичної інженерії Рівень вищої освіти – перший (бакалаврський)
Спеціальність – 152 «Метрологія та інформаційно-вимірювальна техніка»
Освітньо-професійна програма «Біомедичні прилади та інформаційно- вимірювальні системи»
ЗАТВЕРДЖУЮ Завідувач кафедри
_______ Владислав ШЛИКОВ
«___»_____________2021 р.
ЗАВДАННЯ
на дипломну роботу студенту Полуектову Сергію Олександровичу
1. Тема роботи «4Рі мікроскоп для дослідження біологічних середовищ», керівник роботи Савкіна Катерина Олександрівна, ст.викл каф БМІ, затверджені наказом по університету від «27» травня 2021 р. № 1661 .
2. Термін подання студентом роботи: 06.06.2021 р.___________________
3. Вихідні дані до роботи : принцип флуоресцентної мікроскопії, принцип 4Рі мікроскопії, відомості про просторове розсіяння і оптичні властивості біологічних середовищ.
4. Зміст роботи : принцип роботи флуоресцентних мікроскопів, механізми збудження флуорофорів, оптичні властивості біологічних середовищ, принцип флуоресцентної мікроскопії, розробка оптичної схеми 4Рі мікроскопу, підбір компонентів системи 4Рі мікроскопу для дослідження біологічних середовищ,
габаритний розрахунок системи, розробка тримача і корпусу приладу, дослідження просторового розсіяння флуоресценції.
5. Перелік ілюстративного матеріалу (із зазначенням плакатів, презентацій тощо): презентація у MS PowerPoint.
6. Консультанти розділів роботи
Розділ Прізвище, ініціали та посада консультанта
Підпис, дата завдання
видав
завдання прийняв 2, 3 д.т.н. доцент, професор каф. ВП
Безуглий Михайло Олександрович 4 к.т.н. доцент каф. ОПЦБ
Демчук Гліб Вікторович
7. Дата видачі завдання : 18 «травня» 2021 р.»
Календарний план
№ з/п
Назва етапів виконання дипломної роботи
Термін виконання
етапів роботи Примітка 1 Аналіз наукової літератури квітень 2021 р.
2 Розробка 4Рі мікроскопу квітень/травень 2021 р.
3 Дослідження просторового розсіяння флуоресценції
травень 2021 р.
4 Оформлення розділу з «Охорони праці» травень 2021 р.
5 Оформлення ДР червень 2021 р.
6 Отримання рецензії та відгуку червень 2021 р.
7 Надання документів по ДР до захисту
ЕК червень 2021 р.
8 Захист ДР червень 2021 р.
Студент Сергій ПОЛУЕКТОВ
Керівник Катерина САВКІНА
АНОТАЦІЯ
Тема дипломної роботи: “4Рі мікроскоп для дослідження біологічних середовищ”.
Обсяг дипломної роботи становить 55 сторінок, міститься 24 ілюстрацій, 14 таблиць. Загалом опрацьовано 27 джерел.
Актуальність дипломної роботи: З огляду на те, що метод флуоресценції на сьогодні прийнято вважати одним з найбільш чутливих методів, які дозволяють проводити дослідження об’єктів не руйнуючи їх, застосування його в багатьох областях актуально і поширене. Справа в тому, що не тільки в медицині, але і в біології, фізиці, криміналістиці та інших науках використання даного методу дослідження з кожним роком неухильно зростає. А з додаванням cкануючої методики 4Рі, за допомогою якої стає можливо отримати 3D зображення об’єкту та збільшується роздільна здатність, цей прилад є незамінним при точних лабораторних дослідженнях біологічних структур. Серійно 4Рі мікроскопи, не виготовляються, це одиничні виробництва під замовлення, що робить цей прилад недосяжним для звичайних науковців, тому було вирішено розробити модель флуоресцентного скануючого 4Рі мікроскопу.
Мета дипломної роботи: 4Рі мікроскоп.
Завдання дипломної роботи:
1. Визначити основні функціональні елементи 4Рі мікроскопу.
2. Розробити оптичну схему приладу та провести габаритний розрахунок системи.
3. Розробити корпус розробленого 4Рі мікроскопу.
4. Зробити дослідження розсіяння флуоресценції біологічними зразками.
Ключові слова: 4Рі мікроскопія, система об’єктивів, флуоресценція, розсіяння, лазер, індикатриса.
ANNOTATION
Theme of graduate work: "4Pi microscope for biological environment study".
The volume of the thesis is 55 pages, contains 24 illustrations, 14 tables. A total of 27 sources were processed.
Relevance of the thesis: Given that the method of fluorescence is currently considered one of the most sensitive methods that allow the study of objects without destroying them, its application in many areas is relevant and widespread. The fact is that not only in medicine but also in biology, physics, forensics and other sciences, the use of this research method is growing every year. And with the addition of the 4Pi scanning technique, which makes it possible to obtain 3D images of objects and increase resolution, this device is indispensable in accurate laboratory studies of biological structures. Series 4Рi microscopes are not manufactured, they are single production to order, which makes this device unattainable for ordinary scientists, so it was decided to develop a model of a fluorescent scanning 4Рi microscope.
The purpose of the thesis: model 4Рi microscope.
Thesis tasks:
1. Identify the main functional elements of the 4Рi microscope.
2. To develop the optical scheme of the device and to carry out dimensional calculation of system.
3. Develop the body of the developed 4Рi microscope.
4. To study the scattering of fluorescence by biological media
Keywords: 4Рi microscopy, lens system, fluorescence, scattering, laser, indicatrix.
Вим Лист № докум. Підпис Дата
Лист
БП71.13.2705.1661.ПЗ
Розробив Полуектов С.О. 4Рі мікроскоп для Літ. Листів
ЗМІСТ
ВСТУП ... 8
РОЗДІЛ 1 ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТИНА ... 9
1.1 Флуоресцентна мікроскопія ... 9
1.2 Зсув Стокса ... 11
1.3 Методи контрастування в лазерній скануючій флуоресцентній мікроскопії ... 12
1.3 Розсіювальні властивості біологічних середовищ ... 15
1.4 Принцип роботи 4Рі мікроскопу ... 17
Висновки до розділу 1 ... 18
РОЗДІЛ 2 РОЗРОБКА ПРИЛАДУ ... 19
2.1 Розробка оптичної схеми приладу ... 19
2.2. Вибір лазера ... 21
2.3. Вибір камери ... 22
2.4. Вибір системи з об’єктивів... 24
2.5 Функціональна схема розробленого 4Рі мікроскопу ... 27
2.6 Габаритний розрахунок та моделювання системи ... 28
2.7 Розробка корпусу приладу ... 30
Висновки до розділу 2 ... 32
РОЗДІЛ 3 ДОСЛІДЖЕННЯ ПРОСТОРОВОГО РОЗСІЯННЯ ФЛУОРИСЦЕНЦІЇ БІОЛОГІЧНИМИ ЗРАЗКАМИ ... 33
Висновки до розділу 3 ... 38
РОЗДІЛ 4 ОХОРОНА ПРАЦІ ... 39
4.1. Характеристика 4Рі мікроскопу для дослідження біологічних середовищ ... 39
4.1.1 Технічні характеристики компонентів 4Рі мікроскопу ... 39
4.1.2 Складові частини розробленої системи 4Рі мікроскопу ... 40
4.1.3 Характер взаємодії системи 4Рі мікроскопу в системі «людина – об’єкт» ... 41
4.2. Оцінка небезпек, що можуть виникнути через складові елементи розробленого 4Рі мікроскопу, та способи їх усунення ... 42
4.2.1 Небезпека ураження лазерним випромінюванням ... 42
4.2.2 Небезпека ураження електричним струмом ... 44
4.2.3 Інструкція з техніки безпеки при роботі з розробленим 4Рі мікроскопом ... 45
Висновки до розділу 4: ... 47
ВИСНОВОК ... 48
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ ... 49
ДОДАТОК А ... 52
ДОДАТОК Б ... 55
ВСТУП
У сучасному світі все більше постає питання про вирішення проблеми руйнування дифракційного обмеження, та підвищення роздільної здатності.
4Рі мікроскопія наблизилась до максимально малої роздільної здатності у приблизно 50 нм, використовуючи переваги подвійних розташованих поруч об’єктивів [1,4].
З огляду на те, що метод флуоресценції на сьогодні прийнято вважати одним з найбільш чутливих методів, які дозволяють проводити дослідження об’єктів не руйнуючи їх, застосування його в багатьох областях актуально і поширене. Справа в тому, що не тільки в медицині, але і в біології, фізиці, криміналістиці та інших науках використання даного методу дослідження з кожним роком неухильно зростає. А з додаванням cкануючої методики 4Рі, за допомогою якої стає можливо отримати 3D зображення об’єкту та збільшується роздільна здатність, цей прилад є незамінним при точних лабораторних дослідженнях біологічних структур [2,3]. Серійно 4Рі мікроскопи, не виготовляються, це одиничні виробництва під замовлення, що робить цей прилад недосяжним для звичайних науковців, тому було вирішено розробити модель флуоресцентного скануючого 4Рі мікроскопу.
Тема дипломної роботи: 4Pi мікроскоп для дослідження біологічних середовищ.
Мета дипломної роботи: модель 4Рі мікроскопу.
Задачі дипломної роботи:
1. Визначити основні функціональні елементи 4Рі мікроскопу.
2. Розробити оптичну схему приладу та провести габаритний розрахунок системи.
3. Розробити корпус розробленого 4Рі мікроскопу.
4. Зробити дослідження розсіяння флуоресценції біологічними зразками.
РОЗДІЛ 1
ТЕОРЕТИЧНА ЧАСТИНА 1.1 Флуоресцентна мікроскопія
Поглинання і подальше повторне випромінювання світла органічними і неорганічними зразками зазвичай є результатом добре відомих фізичних явищ, описуваних як флуоресценція або фосфоресценція. Випромінюється світло в процесі флуоресценції майже одночасно з поглинанням збуджуючого світла через відносно короткі тривалості затримки між поглинанням і випусканням фотона, зазвичай становить менше мікросекунди. Коли випромінювання зберігається довше після того, як збудливий світло згасло, це явище називається фосфоресценції [5].
Флуоресцентна мікроскопія часто використовується для візуалізації специфічних особливостей невеликих зразків, таких як мікроби. Він також використовується для візуального поліпшення тривимірних об'єктів в невеликих масштабах.[5] Це може бути досягнуто шляхом прикріплення флуоресцентних міток до антитіл. Коли відбите світло і фонова флуоресценція фільтруються в цьому типі мікроскопії, цільові частини даного зразка можуть бути відображені. Схема роботи флуоресцентного мікроскопа зображена на рисунку 1.1.
Рисунок 1.1 – Схема роботи флуоресцентного мікроскопа
У більшості випадків зразок позначається флуоресцентною речовиною, відомою як флуорофор, а потім висвітлюється через лінзу більш потужним джерелом енергії [6]. Випромінюване світло поглинається флуорофором (тепер прикріпленим до зразка) і змушує їх випромінюватись з меншою довжиною хвилі. Це флуоресцентне світло можна відокремитись від навколишнього випромінювання за допомогою фільтрів, призначених для цієї конкретної довжини хвилі, дозволяючи глядачеві бачити тільки те, що флуоресціює.
Основне завдання флуоресцентного мікроскопа складається в тому, щоб дозволити збудливому світлу опромінювати зразок, а потім відсортувати набагато слабший випромінюване світло з зображення. По-перше, у мікроскопа є фільтр, що пропускає тільки випромінюване з певною довжиною хвилі, яка відповідає вашому флуоресцентного матеріалу.
Випромінювання стикається з атомами в зразку, і електрони збуджуються до більш високого рівня енергії. Коли вони розслабляються до нижчого рівня, вони випромінюють світло [6]. Щоб стати тим що виявляється (видимим людським оком), флуоресценція, що випускається зразком, відділяється від набагато більш яскравого збуджуючого світла в другому фільтрі. [7] Це працює, тому що випромінюване світло має більш низьку енергію і велику довжину хвилі, ніж світло, яке використовується для освітлення.
Більшість флуоресцентних мікроскопів, що використовуються сьогодні в біології, є епіфлуоресцентними мікроскопами, що означає, що і збудження, і спостереження флуоресценції відбуваються над зразком. Більшість з них використовують ксенонову або ртутну дугову лампу для більш інтенсивного джерела світла.
1.2 Зсув Стокса
Коливальна енергія втрачається, коли електрони релаксують із збудженого стану назад в основний стан. В результаті втрати енергії спектр випромінювання порушеного флуорофора зазвичай зміщується в бік більш довгих хвиль в порівнянні зі спектром поглинання або збудження, довжина хвилі змінюється обернено пропорційно енергії випромінювання) [8]. Це добре задокументоване явище відоме як закон Стокса або зсув Стокса. У міру збільшення значень стоксова зсуву стає легше відокремити збудження від світла, що випускається за рахунок використання комбінацій флуоресцентних фільтрів.
Пік інтенсивності випромінювання (або поглинання) флуорофора зазвичай менше по довжині хвилі і величиною, ніж пік збудження, а спектральний профіль випромінювання (крива) часто є дзеркальним відображенням (або майже дзеркальним відображенням) кривої збудження, але зміщеним в сторону більш довгих хвиль, як показано на рисунку 1.2 для Alexa Fluor 555, який поглинає світло в жовто-зеленій області і виробляє жовто-помаранчеве випромінювання.
Для досягнення максимальної інтенсивності флуоресценції флуорофор (часто званий барвником) зазвичай порушується на довжинах хвиль, близьких до піку кривої збудження або на його піку, і для виявлення вибирається максимально широкий діапазон довжин хвиль випромінювання, який включає пік випромінювання. Вибір довжин хвиль збудження і випромінювання зазвичай заснований на інтерференційних фільтрах [8].
Крім того, спектральний відгук оптичної системи мікроскопа також буде залежати від таких факторів, як ефективність пропускання через скло, кількість лінз і дзеркальних елементів, а також чутливість детекторної системи.
Рисунок 1.2 – Профілі поглинання і емісії флуорофора
Ефективність, з якою конкретний флуорофор поглинає фотон збуджуючого світла, є функцією молекулярного поперечного перерізу, а ймовірність поглинання відома як коефіцієнт екстинкції [9]. Більш високі коефіцієнти екстинкції вказують на те, що поглинання фотона (або кванта) в даній області довжин хвиль більш ймовірно. Квантовий вихід позначає відношення кількості випускаються квантів до кількості спожитих (і зазвичай становить від 0,1 до 1,0). Значення квантового виходу нижче 1 є результатом втрати енергії через безвипромінювальні шляхи, таких як тепло або фотохімічна реакція, а не через повторне випромінювання флуоресценції.
Коефіцієнт екстинкції, квантовий вихід, середня сила світла джерела світла і час життя флуоресценції - все це важливі фактори, які впливають на інтенсивність і корисність флуоресцентного випромінювання.
1.3 Методи контрастування в лазерній скануючій флуоресцентній мікроскопії
Щоб молекула флуоресцувала, вона повинна поглинути фотон з відповідною кількістю енергії, достатнім для переходу молекули з основного
в збуджений стан. Схематичне зображення даного процесу показано на рисунку 1.3 а.
Рисунок 1.3 — Генерація сигналів в лазерній скануючій мікроскопії (а) – однофотонне збудження, (б) – багатофотонне збудження, (в) – генерація
гармонік
При вимушеному переході молекули із збудженого стану в стан рівноваги вона випускає квант світла. За рахунок природних втрат в процесі релаксації випромінений фотон має меншу енергію і, відповідно, велику довжину хвилі, ніж поглинений фотон. Кількість флуоресценції пропорційно інтенсивності (I) лазерного випромінювання, що висвітлює зразок, тому лазерну конфокальную мікроскопію часто називають методом лінійної візуалізації [10].
Багатофотонне збудження молекули (рисунок 1.3 б) відбувається, коли два (або більше) фотона, енергії яких в сумі задовольняють кількості енергії, необхідної для квантового переходу, поглинаються одночасно. При цьому два поглинених фотона матимуть меншу енергію, ніж випромінюється флуоресціюючий фотон [10].
Також існують схеми багатофотонного контрастування (рисунок 1.3 в), такі як генерація гармонік і генерація сумарної частоти. Ці процеси не
вимагають поглинання енергії [9]. При генерації гармонік падаючі фотони анігілюють, після чого створюється новий фотон, що володіє сумарною енергією. Дослідження в такому випадку відбувається шляхом спостереження за фізичним порядком генерації гармонік.
Двухфотонне збудження і генерація другої гармоніки - нелінійні процеси, так як випромінювання залежить від квадрата інтенсивності (I2). Це означає, що для дослідження генерації другої і третьої гармонік необхідні високі щільності фотонів [8]. Для досягнення необхідної щільності потрібно використовувати потужні джерела лазерного випромінювання, часто застосовуються фемтосекундний імпульсні лазери з фазової синхронізацією (наприклад титан-сапфірові).
Ще одна відмінна риса лінійної мікроскопії - це певна довжина хвилі для збудження конкретної флуорофора. Для збудження більшості флуорофорів потрібні різні довжини хвиль при одно- і двуфотонних поглинаннях. Існують окремі спектри для цих видів поглинання, спектри двухфотонного поглинання часто значно ширше (> 100 нм) і не відповідає гладким полугаусовим кривим.
Широкий спектр двухфотонного поглинання багатьох флуорофорів дозволяє порушувати кілька флуоресцентних молекул одним джерелом лазерного випромінювання, що робить можливим одночасне спостереження флуоресценції від декількох флуорофорів з різною довжиною хвилі збудження [11].
Порушувані в зразку флуорофори можуть мати різний пік збудження, але необхідно, щоб перетиналися довжини хвиль їх збудження. У більшості випадків збудження кількох флуорофорів досягається підбором компромісного джерела випромінювання, довжина хвилі якого збуджує всі флуорофори і забезпечує необхідний рівень їх ефективності.
Розглянемо тепер питання збільшення контрастності при використанні конфокальної оптичної схеми. По-перше, тому що в конфокальному
мікроскопі світло двічі проходить через об'єктив, то функція розмиття точки (далі позначається ФРТ) має наступний вигляд:
𝑃𝑐𝑜𝑛𝑓(ξ, ρ) = 𝑝(ξ, ρ) ∗ 𝑝(ξ, ρ), (1.1)
де 𝑃𝑐𝑜𝑛𝑓 — конфокальна функція розмиття точки, а p — звичайна функція розмиття точки [12].
Таким чином, досяжна товщина фокальної площини визначається в основному довжиною хвилі використовуваного випромінювання, поділеною на числову апертуру об'єктива, а також залежить від оптичних властивостей зразка. Завдяки тонкому оптичному зрізу ці типи мікроскопів особливо ефективні для 3D-візуалізації і поверхневому профілювання зразків.
Послідовні зрізи формують «z-стек», який може бути оброблений певним програмним забезпеченням для створення реконструйованого 3D- зображення або представлений в двомірному стеку для публікації, завдяки поширеній алгоритму пошуку максимуму інтенсивності.
1.3 Розсіювальні властивості біологічних середовищ
Біологічні тканини є оптично неоднорідними поглинаючими середовищами із середнім показником заломлення більшим, ніж у повітря, тому на межі поділу «біологічний об'єкт – повітря» частина випромінювання відбивається, а інша частина проникає в біотканину [13]. Об'ємне розсіяння є причиною поширення значної частки випромінювання в зворотному напрямку (зворотне розсіяння). Ця властивість істотно знижує можливості вимірювальних засобів, у тому числі томографічних систем, обмежуючи глибину зондування (максимальна відстань від поверхні середовища до неоднорідності того чи іншого типу, де вона ще може бути виявлена) і
мінімальний розмір об'єктів, зображення яких може бути отримане. Окрім того, для визначення оптимальної довжини хвилі і побудови алгоритмів вирішення зворотних задач томографії необхідні апріорні дані про оптичні властивості досліджуваних тканин [24]. Таким чином, дослідження просторового розсіяння лазерного світла в оптично мутних біологічних середовищах залишається актуальним.
Вимірювання індикатриси полягає в освітленні біологічного об'єкту пучком світла і реєстрації розсіяного випромінювання під різними кутами в межах повного тілесного кута (рисунок 1.4). Для задач біофотоніки найбільш прийнятним вважається застосування колімованого світла, тому доцільно використовувати лазерні джерела, що забезпечують значну направленість і високу інтенсивність випромінювання [24].
Рисунок 1.4 – Індикатриса релєєвського розсіяння
При розсіянні фотона напрямок його поширення змінюється на випадковий кут, який має певний розподіл ймовірності, яке і вважають фазовою функцією, тобто фазова функція визначає ймовірність того, що фотон, що летить в напрямку поширення світла, після розсіяння змінить свій напрямок з ймовірністю g [25]. Параметр g – фактор анізотропії розсіяння – характеризує фазову функцію ймовірності і є середнім косинусом кутів розсіяння. Значення g змінюється від - 1 до 1, причому g = 0 відповідає випадку ізотропного (розсіяння Релея) розсіяння, а g = 1 – повного розсіяння вперед (розсіяння Мі на великих частинках). Найбільш частою при моделюванні анізотропного розсіяння є фазова функція Хені-Грінштайна, яка безпосередньо включає фактор анізотропії [27].
1.4 Принцип роботи 4Рі мікроскопу
Поліпшення роздільної здатності досягається за рахунок використання двох протилежних лінз об’єктива, які фокусуються в одному і тому ж геометричному місці. Крім того, різниця в довжині оптичного шляху через кожну з двох лінз об’єктива ретельно поєднана, щоб бути мінімальною. За допомогою цього методу молекули, що знаходяться в загальній фокальній області обох об’єктивів, можуть когерентно висвітлюватися по обидві сторони, а відбите світло або світло що випромінюється також може бути когерентно зібране, тобто можливо когерентне накладення випромінюваного світла на детектор. Тілесний кут Ω, який використовується для освітлення і виявлення збільшується і наближається до свого максимуму. В цьому випадку зразок висвітлюється і детектується з усіх боків одночасно [14].
Режим роботи мікроскопа 4Pi показаний на рисунку 1.5. Лазерне світло розділяє світлодільник і направляється дзеркалами на дві протилежні лінзи об’єктива. У загальній фокусній точці відбувається накладення обох сфокусованих світлових променів. Збуджені молекули в цьому положенні випромінюють флуоресцентне світло, яке збирається обома лінзами об’єктива, об’єднується одним і тим же світлодільником і відхиляється дихроїчним дзеркалом на детектор. Тут знову може мати місце накладення обох випромінюваних світлових шляхів [15].
В ідеальному випадку кожна лінза об’єктива може збирати світло під тілесним кутом. З двома лінзами об’єктива можна збирати з усіх боків (тілесного кута). Назва цього типу мікроскопії походить від максимально можливого тілесного кута для збудження і виявлення. Практично для лінзи об’єктива можна отримати тільки апертурні кути близько 140 °.
Рисунок 1.5— Принцип роботи 4Рі мікроскопу
Біологічні зразки зазвичай мають недостатній рівень контрасту, що призводить до труднощів в дослідженні структур цих зразків. Одним з ефективних методів поліпшення контрастності в лазерних скануючих мікроскопах є використання флуоресценції [16].
При флуоресценції світловипромінююча молекула помітна на тлі інших молекул, що складають загальну структуру. Якщо досліджуваний зразок не містить такі молекули, їх впроваджують в тканину ззовні – хімічно або шляхом трансфікування флуоресцентних білків в клітку [16].
Висновки до розділу 1
У даному розділі були наведені функціональні особливості 4Рі мікроскопу, шляхи збудження та збору флуоресценції . На основі цього було визначено, що основними складовими частинами даних пристроїв є: два протилежних об’єктиви, дільник променю, який формує два інтерферометричних плеча. Визначені переваги флуоресцентної мікроскопії, та механізми контрастування зразків. Досліджена інформація буде використана, для проектування 4Рі мікроскопу у наступному розділі.
РОЗДІЛ 2
РОЗРОБКА ПРИЛАДУ
Ідея, яку покладено в 4Pi-мікроскоп що розробляється, полягає в тому, щоб імітувати ситуацію, близьку до ідеальної, за рахунок когерентного використання двох протилежних лінз об’єктива, так що два хвильових фронти підсумовуються і об’єднують сили.
2.1 Розробка оптичної схеми приладу
У загальному випадку 4Pi стенд є складовою частиною конфокального сканера, для реєстрації флюоресценції. Проте було вирішено розробити прилад автономним і самодостатнім.
Було розроблено оптично-функціональну схему 4Рі мікроскопу (рисунок 2.1).
Рисунок 2.1 – Оптично-функціональна схема 4Рі мікроскопу
Для збудження флуорофора промінь лазера з синхронізацією мод вводиться в мікроскоп (сині стрілки), розділяється світлодільником BS і
фокусується в тому ж місці протилежними лінзами об’єктива O1 і O2. Лінзи L1, L2 і дзеркала M1, M2, M3 і M4 утворюють проміжну оптичну систему, гарантуючи, що дві точки повороту сканування збігаються з вхідними зіницями двох лінз об’єктива. Флуоресценція (червоні стрілки) збирається обома лінзами, рекомбінує на BS і направляється до камери сканування.
Ірісові діафрагми D1, D2, D3 виконують роль апертурної діафрагми D1 і D2, польової D3, яка розташована у площині проміжного зображення після світлодільника BS. Апертурні діафрагми D1 і D2 обмежують розмір осьового пучка, а польова діафрагма D3 омежує розмір поля. Складаються з тонких металевих пластинок, які регулюють розмір отвору діафрагми, при зміні якого можлива регулювати світлосилу і добитися необхідної експозиції.
Налаштування відбувається кожен раз перед використанням приладу
Довжина оптичного шляху двох променів у прямому і зворотному напрямку однакова, тому визначивши геометричні місця дзеркал ті їх кути повороту, та розрахувавши лінзу для одного плеча, доцільно використовувати ці дані і для другого.
Кути повороту дзеркал були підібрані виходячи з основного закону оптики, про відбиття. Який каже , що кут падіння дорівнює куту відбиття.
Лазерний промін у світлодільнику BS, ділиться на два промені де один проходить на заломлюючись, а інший заломлюється під кутом 90˚ (рисунок 2.2 в). Тобто два плеча та оптичний шлях де знаходяться об’єктиви утворюють прямокутний трикутник, що є зручним для подальшого габаритного розрахунку системи
Рисунок 2.2 – Кути нахилу дзеркал М1і М3 (а), М2 і М4(б) і геометрія проходження променю крізь світлодільник BS
2.2. Вибір лазера
У сучасні флуоресцентних мікроскопах використовують високочастотні лазери, що випускають імпульси тривалістю кілька десятків фемтосекунд, що забезпечує високу щільність фотонного потоку, яка необхідна для фотонного поглинання при 4Рі мікроскопії.
Серед серійних моделей, було обрано фемтосекундний переналаштовуємий титан-сапфіровий лазер Tiberius® Thorlabs, технічні характеристики якого подані у таблиці 2.1 [17].
Таблиця 2.1 Технічні характеристики титан-сапфіровий лазер Tiberius®
Thorlabs
Технічні характеристики Характеристики лазера
Діапазон налаштування 720 - 1060 нм
Ширина імпульсу 140 фс
Середня потужність > 1,0 Вт при 720 нм
> 2,3 Вт при 800 нм
> 1,4 Вт при 920 нм
> 0,5 Вт при 1000 нм
> 0,3 Вт при 1040 нм
Шум a <0,15% (середньоквадратичне
значення)
Швидкість повторень 77 МГц (номінальний)
Діаметр променя (1 / e 2 ) 1,5 мм (номінальна)
М 2 <1,2 при 800 нм
Вказівка на стабільність під час налаштування <50 мкрад на 100 нм Електричні вимоги
Вхідна напруга 100 - 240 В
Частота 50 - 60 Гц
Споживання енергії 1,2 кВт (макс.)
Екологічні вимоги
Кімнатна температура 17-25 ° C
Стабільність кімнатної температури <3 ° C протягом 24 годин Розміри корпусу 29,38 "x 7,48" x 11,32 "
(746,3 x 190,0 x 287,4 мм)
Зовнішній вигляд та габаритні розміри обраного титан-сапфірового лазеру Tiberius® Thorlabs зображені на рисунку 2.3.
Рисунок 2.3 – Габаритні розміри фемтосекундного титан-сапфірового лазеру Tiberius® Thorlabs
Переваги обраного лазеру:
• широкий діапазон переналаштування довжини хвилі – від 720 до 1060 нм з точністю до 1 нм;
• надшвидкі імпульси тривалістю 140 фс;
• компактні розміри в половину від займаного простору конкуруючими лазерами;
• вбудований спектрометр для діагностики в реальному часі.
У комплект поставки кожного лазера Tiberius також входить лазерний контролер, лазерний контролер накачування, блок охолодження і блок циркуляції чистого повітря. Схеми з’єднання, налаштування та програмне забезпечення яке використовується для керування лазером надані у додатку А.
2.3. Вибір камери
Була обрана камера Leica DFC9000 sCMOS – монохромна камера мікроскопа з технологією сенсора CMOS (sCMOS) для флуоресцентної візуалізації дозволяє отримувати зображення клітин в умовах, близьких до природних (рисунок 2.4). Програмне забезпечення LAS X дозволяє керувати камерою, виводити зображення та робити 3D рендерінг, що необхідно для
реалізації 4Рі мікроскопу. Інтерфейс програмного забезпечення наведено у додатку Б. [18] Технічні характеристики камери надані у таблиці 2.2.
Таблиця 2.2 – Технічні характеристики
Тип камери Монохромна флуоресцентна камера 4,2 Мп sCMOS
Датчик Науковий CMOS CIS2020A з передньою підсвіткою від BAE Затвор Ролети з глобальним скиданням
Піксель 2048 x 2048 (4,2 МП); 6,5 мкм х 6,5 мкм розмір пікселя Розмір датчика 13,3 x 13,3 мм (діагональ ~ 19 мм)
Швидкість придбання
*
50 кадрів в секунду (USB 3.0); > 90 кадрів в секунду (посилання на камеру)
Максимальна
квантова ефективність ~ 82% при 580 нм Глибина біта 12 біт / 16 біт
Охолодження 0 ° C при 27 ° C навколишнього середовища, з повітряним охолодженням
Бінінг (апаратне бінінг)
2x2, 3x3, 4x4, 8x8
Часткове сканування Вільно визначається регіон інтересу (ROI), поєднання з можливістю сміття
Внутрішня пам’ять 1 Гб
Темна течія ~ 0,14 e- / px / sec Шум читання 0,9 е-
Динамічний діапазон 1: 33000 Частота тактової
частоти пікселів
540 МГц / 216 МГц Підтримувані
операційні системи
Windows 7 і Windows 8 Програмне
забезпечення
Leica Application Suite (LAS) X
С-кріплення 1x для перевернутих і вертикальних складених мікроскопів Інтерфейси USB 3.0 або Camera Link
Пакет камери Пакет камери включає головку камери, кабелі та плату PCIe, DVD- диск LAS X та інструкції для використання
Рисунок 2.4 – Камера Leica DFC9000 sCMOS
Технологія sCMOS максимально адаптована до вимог наукових досліджень, цей тип датчика має цілий ряд переваг, таких як низький рівень
шуму, висока однорідність, висока частота кадрів і високий динамічний діапазон. Все це забезпечує продуктивність в задачах флуоресцентної візуалізації або відеозйомки живих нефарбованих клітин при низькій освітленості. На рисунку 2.5 зображені зони квантової ефективності в залежності від довжини хвилі.
Рисунок 2.5 — Квантова ефективність камери Leica DFC9000 sCMOS Можна помітити що зони квантової ефективності для випромінювання флуоресценції мають широкий діапазон довжин хвиль, що дозволяє мати широкий вибір флуорофорів для введення у зразок.
2.4. Вибір системи з об’єктивів
Розроблений 4Рі мікроскоп зосереджен навколо двох протилежних іммерсійних лінз об’єктива з числовий апертурою 100 × / 1,35 (NA) (Olympus, UPLSAPO 100XS), OBJ0 і OBJ1 [19]. Основною вимогою до яких було значення числової апертур та збільшення, які дозволять чітко розрізняти найдрібніші мікроструктури біологічної тканини (табл. 2.3).
Таблиця 2.3 – Технічні характеристики об’єктиву
Характеристика Значення
Збільшення 100х
Числова апертура (NA) 1.35
Робоча відстань 0,2 мм
Імерсійна рідина силіконна олія (n=1,4)
Число поля (FN) 22 мм
Зображення системи об’єктивів Olympus, UPLSAPO 100XS 100 × / 1,35 та габаритні розміри зображено на рисунку 2.6.
Рисунок 2.6 – Система об’єктивів Olympus, UPLSAPO 100XS 100 × / 1,35 Поле зору (FN) в мікроскопії визначається як діаметр області в проміжній площині зображення, яку можна спостерігати через окуляр. Число поля становить 22 мм, це вказує на те, що спостережувана площа зразка після збільшення лінзою об’єктива обмежується діаметром 22 мм. Лінза об’єктива має збільшення, 100x з FN 22 мм, можна спостерігати ділянку зразка діаметром 220 мкм [20].
Оптична роздільна здатність (dA) можна визначити за формулою Аббе:
𝑑𝐴 = 𝜆
2𝑁𝐴 = 720 нм
2 ∗ 1,35≈ 423 нм,
де 𝜆 – довжина хвилі випромінювання ( для прикладу була обрана можлива з діапазону обраного лазера), 𝑁𝐴 – числова апертура (1,35).
Очевидно, що збільшення об’єктива не впливає на оптичну роздільну здатність, щоб її зберегти при скануванні зразка, а також інтенсивність в цифровому зображенні, розмір елементів зображення, що проектуються назад з зразка, повинен бути менше оптичної роздільної здатності.В іншому випадку цифрове зображення містить менше інформації, ніж оптичне. Відповідно, необхідний мінімальний розмір пікселя (dр) можна розрахувати як:
𝑑𝑝 = 𝜆
4𝑁𝐴= 720 нм
4 ∗ 1,35 ≈ 133 нм,
У підібраній камері Leica DFC9000 sCMOS розмір пікселя 6,5 мкм, що є більшим за 133 нм і надає не максимальну точність, але достатню для дослідження необхідних біологічних структур.
Отже підібрані об’єктиви в значній мірі відповідають вимогам приладу.
Та в технічних характеристиках зазначена робоча відстань 0,2 мм. Тому постає наступна проблема розташування біологічного зразка між двох протилежних об’єктивів. Для вирішення цього питання був розроблен нестандартний тримач (рис. 2.7). Система розміщення зразка складається з тримача, два покривних скла та двокомпонентного герметика, який надійно герметизує зразок і запобігає потраплянню повітря.
а) б)
Рисунок 2.7 – Розроблений тримач зразка у середовищі SolidWorks:
a) покомпонентно зображено тримач зразка і вузла покривного скла;
b) результуюча геометрія тримача зразка
Тримач зразка кріпиться безпосередньо до системи об’єктивів і не потребує додаткового кріплення або предметного стола, що робить розташування зразка зручним, та виконує вимогу об’єктива з робочою відстанню (0,2 мм).
2.5 Функціональна схема розробленого 4Рі мікроскопу
Схема з’єднання та регулювання компонентами 4Рі мікроскопу наведена на рисунку 2.8.
Рисунок 2.8 – Функціональна схема розробленого 4Рі мікроскопу для дослідження біологічних середовищ
Розроблена структурна блок-схема системи 4Рі мікроскопу містить блок безпосередньо оптичний блок мікроскопу 7, який включає 1 – камера, 2 – лазерний випромінювач; блок лазера 8 з допоміжними компонентами: 3 – контролер лазерної накачки, 4 – циркулятор чистого повітря, 6 – чілер, 5 – лазерний контролер, який керує усіма компонентами лазерної системи. ПК –
персональний комп’ютер, який за допомогою спеціального програмного забезпечення керує камерою 1, та головним контролером 5.
Усі компоненти лазерного блоку мають зворотній зв'язок з лазерним контролером який містить індикацію порушень системи та зв'язок з ПК, для передавання помилок.
Допоміжні компоненти лазерної системи 8 запобігають перегріванню лазера. Камера 1, контролер 5 та ПК підключаються до мережі живлення 220В.
2.6 Габаритний розрахунок та моделювання системи
Система з об’єктивів кожен з яких має довжину 45,06 мм , збільшує систему, адже система об’єктивів та тримач зразка складають приблизно 95 мм.
Розроблений 4Рі мікроскоп скоригован на нескінченність, що дозволяє з мінімальними абераційними ефектами і расфокусуванням вставляти додаткові компоненти. Тому промені від флeорисценції які виходять з об’єктивів (OBJ1, OBJ2) паралельні, а область зображень знаходиться в нескінченності. Для формування проміжного зображення в тубус мікроскопа, між об’єктивом і окуляром, вставляється тубусна лінза (L1, L2).
Довжина тубуса в скоригованих на нескінченність мікроскопах називається опорною фокусною відстанню і лежить в інтервалі від 160 до 200 міліметрів в залежності від виробника. Фокусна відстань тубусної лінзи була обрана 200 мм, і місце фокусування є місцем проміжного зображення. Діаметр вихідного пучка об’єктиву дорінює 20,32 мм, виконавши геометричний розрахунок на відстані 111,7 мм від фокусу діаметр зображення на матриці камери буде складати 11,7 мм , що менше ніж розміри матриці камери Leica DFC9000 sCMOS 13,3 x 13,3 мм. Тобто навіть якщо будуть незначні похибки при реалізації приладу, є запас точності (рисунок 2.9).
Рисунок 2.9 – Габаритні відстані оптичної системи одного з інтерферометричних плеч
Було розраховано радіуси кривизни для фокусної відстані 200 мм.
Обидві сферичні поверхні опуклою стороною знаходяться у повітрі, оптично менш щільному середовищі, отже, радіуси кривизни поверхонь увійдуть в формулу для розрахунку зі знаком «+».
1
𝐹 = (𝑛 − 1) (1
𝑅1 + 1
𝑅2+(𝑛−1)𝑑
𝑛𝑅1𝑅2) (2.1)
1
200= (1,5 − 1) ( 1
202+ 1
202+ (1,5 − 1)10 1,5 ∗ 202 ∗ 202)
Коефіцієнт заломлення був обран n = 1,5 – невитончене скло , яке є найдоступнішим матеріалом для лінз. Та радіуси кривизни, однакові і дорівнюють 202 мм, товщина лінзи складає 10 мм.
Вірність розрахунків кутів нахилу дзеркал, та підбір габаритних розмірів системи були спроектовані в програмному забезпеченні для оптичного моделювання 3DOptix [21]. Також у системі було зроблено підбір дзеркал та тримачів оптичних елементів з можливістю їх юстування і заміни (рис. 2.10 – 2.11).
D1/D2
Рисунок 2.10 – Габаритні розміри спроектованої система 4Рі мікроскопу без об’єктивів в середовищі 3DOptix
Рисунок 2.11 – Спроектована система 4Рі мікроскопу без об’єктивів (вид збоку) в середовищі 3DOptix
2.7 Розробка корпусу приладу
У середовищі для моделювання SolidWorks2008, враховуючі габаритні розміри системи та її компонентів був спроектован корпус розробленого 4Рі
мікроскопу (рисунок 2.12), адже потрапляння світла, пилу та інших механічних завад погано впливає на точність і загальну роботу системи
Рисунок 2.12 – Спроектований корпус 4Рі мікроскопу середовище SolidWorks Для лазера і камери були спроектовані комірки, з обмежуючими порогами, для точного встановлення елемента. Задні панелі яких будуть знаходитись у відповідних отворах, тому що на них розташовані вентиляційні отвори, що запобігає перегріванню приладу (рисунок 2.12 – 2.13) .
Рисунок 2.13– Спроектований корпус 4Рі мікроскопу середовище SolidWorks Елементи оптичної системи кріпляться на монтажній платі (рисунок 2.10 – 2.11), а сама плата прикручується болтами у відповідно зроблені отвори, що дає можливість робити заміну елементів, та робити їх юстування.
